張樂(lè)，鞏新，劉波，吳軍

軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）屬副黏病毒科肺炎病毒屬，為單股負(fù)鏈RNA病毒，是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒病毒性急性下呼吸道疾病（acute lower respiratory tract illness，ALRI）最重要的病原體[1]。2歲以下的兒童中，因感染RSV而住院治療的人數(shù)約占呼吸道疾病住院率的50%，其中2～4月齡的嬰兒是住院主要人群[2]。據(jù)報(bào)道，幾乎所有的兒童在2歲時(shí)都經(jīng)歷過(guò)RSV感染，而生命中出現(xiàn)反復(fù)感染是由于免疫力低下[3]。虛弱的老年人在感染RSV后死亡率大幅增加，通常表現(xiàn)為心臟和肺部疾病的并發(fā)癥以及肌力減弱。由于嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷癥、異體骨髓移植或衰老而導(dǎo)致肺部CD8 T細(xì)胞功能減退的人也會(huì)因感染RSV而患上嚴(yán)重疾病。目前尚未有安全有效的RSV疫苗上市，世界衛(wèi)生組織已將研制RSV疫苗列為全球疫苗計(jì)劃的優(yōu)先發(fā)展計(jì)劃之一。

RSV基因組全長(zhǎng)15 222 bp，編碼11種蛋白，其中F蛋白和G蛋白是主要的保護(hù)性抗原[4]，根據(jù)G蛋白的差異可以分成A、B共2個(gè)亞型[5]。F蛋白在不同亞型間相對(duì)保守，蛋白同源性高達(dá)90%，可誘導(dǎo)同時(shí)抵抗A、B亞型感染的中和抗體，并且在病毒顆粒侵入宿主細(xì)胞，與細(xì)胞融合過(guò)程中起重要作用[6]，因此較多的抗體、疫苗研究都集中在F蛋白。

RSV的F蛋白是包含574個(gè)氨基酸殘基的Ⅰ型糖蛋白，根據(jù)菌株的不同，F(xiàn)蛋白有5～6個(gè)N糖基化修飾。在合成過(guò)程中，RSV首先合成F蛋白前體（F0），為N端糖基化蛋白，沒(méi)有受體結(jié)合活性，3個(gè)F0單體組裝成1個(gè)三聚體，當(dāng)三聚體穿過(guò)高爾基體時(shí)，單體被蛋白酶酶切，其N(xiāo)端和C端產(chǎn)物分別為F2和F1片段，通過(guò)二硫鍵連接[7]，主要的抗原表位多集中于F1片段，例如抗原位點(diǎn)Ⅱ（255～275殘基）和Ⅳ（422～438殘基），其中F蛋白的抗原位點(diǎn)Ⅱ就是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的人源化鼠單克隆抗體——帕利珠單抗（Palivizumab）的識(shí)別表位[8]。F蛋白的研究在RSV的治療與預(yù)防方面占有較大比重，但缺乏商業(yè)化的高效、特異性的RSV F蛋白檢測(cè)抗體。因此，我們選取RSV F蛋白抗原表位較集中的F1片段膜外區(qū)作為目的片段（圖1）[9]，利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得目的蛋白，免疫大耳白兔，收集血清抗體，同時(shí)利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)RSV F蛋白膜外區(qū)作為Western印跡檢測(cè)的目的抗原，檢測(cè)證明血清抗體的特異性。制備的多克隆抗體為后續(xù)RSV F蛋白疫苗的研究及單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。

圖1 呼吸道合胞病毒F蛋白結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1 材料

2 kg以上雌性大耳白兔購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；人胚腎細(xì)胞HEK293T、表達(dá)質(zhì)粒pET-28a由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Trans5α、BL21（DE3），TaqDNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Q5熱啟動(dòng)高保真DNA聚合酶、NdeⅠ和XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶、彩色預(yù)染蛋白marker購(gòu)自NEB公司；異丙基-β-D硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；帶有HRP的抗His標(biāo)簽單克隆抗體購(gòu)自Abmart生物醫(yī)藥（上海）有限公司；RSV F蛋白全基因序列及PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；質(zhì)粒小提中量試劑盒、DNA純化回收試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司；弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑、LipofectAMINE 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自ThermoFisher公司；Goat Anti Rabbit IgG X-Adsorbed-HRP購(gòu)自Sigma公司。

1.2 目的基因的獲取

在NCBI網(wǎng)站檢索獲取RSV F蛋白的全長(zhǎng)基因序列（GenBank：FJ614814.1）,委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，選取抗原表位較集中的F1片段膜外區(qū)（137～523殘基）設(shè)計(jì)引物 RSV F1-5（5′-GGGCATATGTTCCT GGGTTTCCTATTGGGA-3′，下劃線序列為NdeⅠ酶切位點(diǎn)）和 RSV F1-3（5′-AAACTCGAGGCCGCC GCCGCCAATCGTAGATTTGCCGGCATTGAC-3′，下劃線序列為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），添加His-Tag，PCR擴(kuò)增RSV F1-His基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用DNA回收試劑盒回收PCR片段。

1.3 大腸桿菌表達(dá)載體F1-His-pET-28a的構(gòu)建

質(zhì)粒pET-28a及PCR回收片段經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切處理后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及回收，用T4DNA連接酶將RSV F1片段與線性質(zhì)粒連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆后委托華大基因公司對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序正確的單克隆接種含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pET28a-F1-His。

1.4 pET28a-F1-His在原核細(xì)胞中的表達(dá)與純化

將pET28a-F1-His轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆接種含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按5%的接種量接種至含卡那霉素的Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液D600nm值達(dá)0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)8 h后離心收集菌體，用水重懸，超聲波破碎菌體后于12 000 r/min離心10 min，分離上清和沉淀；用同樣方法培養(yǎng)和誘導(dǎo)大腸桿菌BL21（DE3）作為陰性對(duì)照，通過(guò)Western印跡檢測(cè)目的蛋白是否表達(dá)。

將確定表達(dá)的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，超聲波破菌后收集破菌沉淀，用pH9.0的Tris-HCl、8 mol/L尿素洗滌，12 000 r/min離心30 min，沉淀經(jīng)pH8.5的Tris-HCl、6 mol/L胍鹽溶解1 h，離心后調(diào)整上清pH值至7.5，進(jìn)行鎳離子親和層析柱純化，收集純化洗脫液，透析至PBS緩沖液中，用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 抗RSV F蛋白多克隆抗體的制備

選擇2 kg以上的雌性大耳白兔，將從SDSPAGE凝膠上切下的目的蛋白膠條用研缽碾磨，加入適量生理鹽水重懸作為抗原，首次免疫混合等量的弗氏完全佐劑，冰浴超聲波混勻后，背下皮下多點(diǎn)免疫；此后的加強(qiáng)免疫均與弗氏不完全佐劑等量混合，分別于2周后、4周后進(jìn)行第2次和第3次免疫，最后一次免疫10 d后勁動(dòng)脈取血，4000 r/min離心20 min分離血清，分裝后保存于-80℃。

1.6 Western印跡檢測(cè)多克隆抗體的特異性

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，接種至24孔板，每孔約2×105細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜，待匯合度為70%～90%時(shí)，采用LipofectAMINE 3000轉(zhuǎn)染表達(dá)RSV F蛋白膜外區(qū)的質(zhì)粒，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)培養(yǎng)HEK293T空細(xì)胞作為陰性對(duì)照，48 h后一同收集培養(yǎng)上清。將培養(yǎng)上清進(jìn)行12%的SDS-PAGE，半干法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%的牛奶封閉液室溫封閉1 h，對(duì)照組用抗His-tag（稀釋度為1∶5000）抗體孵育，實(shí)驗(yàn)組以收集的兔血清為一抗，5%牛奶稀釋?zhuān)ㄏ♂尪葹?∶2000）孵育1 h，PBST洗滌5次，每次5 min，轉(zhuǎn)到用5%牛奶以1∶5000稀釋度稀釋的二抗（Goat Anti Rabbit IgG X-Adsorbed-HRP）孵育1 h，PBST洗滌，用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體pET28a-F1-His的構(gòu)建及鑒定

設(shè)計(jì)引物對(duì)F1片段膜外區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2A），純化回收PCR產(chǎn)物，同時(shí)與表達(dá)載體pET-28a一同酶切，純化回收酶切產(chǎn)物；用T4DNA連接酶連接目的片段與載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-F1-His（圖3）；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定陽(yáng)性克?。▓D2B）；將陽(yáng)性克隆委托測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示插入表達(dá)載體pET28a-F1-His的F1編碼序列完全正確。

圖2 RSV F基因的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增圖譜（A）及菌落PCR篩選鑒定陽(yáng)性克?。˙）

圖3 pET28a-F1-His表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

2.2 重組表達(dá)載體在原核細(xì)胞中的表達(dá)及純化

將重組表達(dá)載體pET28a-F1-His轉(zhuǎn)化宿主菌，與大腸桿菌BL21（DE3）空白菌同條件培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，破碎菌體并離心后進(jìn)行Western印跡，全菌裂解液及離心后的沉淀中在相對(duì)分子質(zhì)量約44×103處均存在蛋白條帶（圖4A），與理論大小一致，說(shuō)明pET28a-F1-His在大腸桿菌中得到表達(dá)且以包涵體形式存在；在相對(duì)分子質(zhì)量約32×103處有一條帶，可能為蛋白降解條帶。擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，收集菌體，破菌、溶解后進(jìn)行鎳柱親和層析純化，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約44×103處有與目的條帶大小一致的條帶（圖4B），表明通過(guò)洗滌和溶解純化的過(guò)程，獲得了相對(duì)較純的RSV F1蛋白。切膠碾磨44×103處的目的條帶，進(jìn)行免疫。

圖4 F1蛋白膜外區(qū)在原核細(xì)胞中表達(dá)的Western印跡（A）及純化圖（B）

2.3 RSV F蛋白兔源多克隆抗體特異性檢測(cè)

以3次免疫后獲得的兔源血清抗體作為一抗（稀釋度為1∶2000），帶HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體作為二抗進(jìn)行Western印跡，檢測(cè)血清中多克隆抗體的特異性，同時(shí)以抗His-tag抗體（稀釋度為1∶5000）為對(duì)照，HEK293T細(xì)胞表達(dá)的RSV F蛋白的膜外區(qū)作為檢測(cè)用目的蛋白。F全長(zhǎng)蛋白在表達(dá)過(guò)程中會(huì)被酶切成F1（相對(duì)分子質(zhì)量44×103）、F2（相對(duì)分子質(zhì)量18×103）2個(gè)片段，Hig-Tag添加在F1 C端。結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約44×103處檢測(cè)到目的蛋白（圖5A），HEK293T空細(xì)胞中無(wú)條帶，與抗His-tag抗體檢測(cè)結(jié)果一致（圖5B）；對(duì)應(yīng)的SDS-PAGE分析顯示培養(yǎng)上清存在較多雜蛋白，說(shuō)明制備的兔源多克隆抗體能特異性檢測(cè)出RSV F蛋白的表達(dá)。

圖5 HEK293T細(xì)胞表達(dá)RSV F蛋白的膜外區(qū)Western印跡（A）及 SDS-PAGE（B）

3 討論

RSV F蛋白較為保守，能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，又能誘發(fā)輔助T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，在病毒顆粒侵入宿主細(xì)胞時(shí)，促使病毒與細(xì)胞之間膜的融合，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞之間發(fā)生融合，形成合胞體[10]，是RSV研究中的重要蛋白。由于缺乏特異性的RSV F蛋白檢測(cè)抗體，實(shí)驗(yàn)研究中多采用His-tag抗體進(jìn)行檢測(cè)，而在疫苗的研發(fā)及制備中不能攜帶His-tag等外源標(biāo)簽，使得后續(xù)操作須去除His-tag，具有一定的局限性，因此，特異性的RSV F蛋白多克隆抗體研制極具意義。本研究利用原核細(xì)胞表達(dá)RSV F蛋白的F1片段膜外區(qū)，并制備兔源多克隆抗體，為RSV F蛋白的研究提供檢測(cè)抗體，為深入探索F蛋白在RSV感染致病機(jī)理中的作用機(jī)制以及疫苗的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

RSV是引起兒童及老年人嚴(yán)重下呼吸道疾病的主要原因，由于感染反復(fù)多發(fā)，波及人群廣，導(dǎo)致了較高的住院率及死亡率，造成了一定的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[11]。目前，在RSV感染的治療方面，采用的核酸類(lèi)似物利巴韋林屬于廣譜抗病毒藥物，大劑量長(zhǎng)期使用可能會(huì)出現(xiàn)白細(xì)胞減少，引起溶血性貧血等副作用；單克隆抗體Palivizumab（Synagis）可抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞，但價(jià)格十分昂貴，限制了其廣泛使用；而其多克隆抗體雖占有較大的市場(chǎng)份額，但由于是血源制品，來(lái)源有限且有污染的可能，存在較大風(fēng)險(xiǎn)[12]。盡管隨著數(shù)十年來(lái)醫(yī)學(xué)生物學(xué)的發(fā)展，RSV的疫苗研究取得了一定的進(jìn)展，但目前還沒(méi)有相應(yīng)的疫苗上市，大部分疫苗的研究主要集中于F蛋白，部分基因載體疫苗、亞單位疫苗及減毒活疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，能否誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的保護(hù)性抗體，誘導(dǎo)平衡的Th1/Th2型應(yīng)答是RSV疫苗研究的熱點(diǎn)[13]。我們希望針對(duì)這些重要呼吸道病原的安全、有效的疫苗或藥物可以盡早出現(xiàn)。