熊芮，范昌發(fā)，王佑春

中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所，北京 100050

隨著現(xiàn)代組織學分析技術(shù)的發(fā)展，僅僅測量勻漿組織中分子的平均表達量已不能滿足研究人員的需求，在保持細胞和組織結(jié)構(gòu)特征的同時，得到檢測目標詳盡的空間分布信息以及精確可靠的定量結(jié)果在研究中變得越來越重要。使用傳統(tǒng)方法，在福爾馬林固定石蠟包埋組織切片上對多個目標信號共定位，在實驗操作上十分具有挑戰(zhàn)性。組織切片多光譜定量分析技術(shù)的高分辨率與高靈敏度，克服了傳統(tǒng)分子成像技術(shù)的不足，為免疫細胞表型分析、定位和定量提供了新思路，被廣泛用于腫瘤免疫學研究。

1 組織切片多光譜定量分析技術(shù)的原理

組織切片多光譜定量分析技術(shù)是近幾年建立起來的一種新技術(shù)[1]，與流式細胞術(shù)類似，它能夠定量評估細胞表型及活性，還可以同時提供組織背景和相關(guān)細胞與細胞相互作用的信息，而這些信息難以或不可能通過其他方法獲得[2]，故該技術(shù)在生命科學、醫(yī)學研究中有其獨到用途。該技術(shù)包括三個部分：①多重免疫熒光標記，可通過獨有的抗原直標和抗體去除技術(shù)，并借助酪酰胺信號放大（tyramide signal amplification，TSA）的作用[3]實現(xiàn)在同一切片上進行多重免疫熒光染色（標記原理如圖1），在同一張完整的組織切片中同時清晰成像和進行數(shù)據(jù)分析的免疫熒光標記可多達7個。②多光譜成像（multispectral imaging，MSI）與光譜拆分算法（圖2），組織自發(fā)熒光和相互重疊的顏色信號會嚴重干擾實驗結(jié)果，光譜拆分技術(shù)能夠拆分發(fā)射峰相近的熒光標記信號[4]，多光譜成像技術(shù)可將顏色信號以連續(xù)光譜的方式記錄，得到經(jīng)修正的單通道圖像，最后為光譜拆分后的單通道圖像添加偽彩，重新生成多通道圖像。與普通的RGB成像相比，多光譜成像能夠識別細微的顏色差異，在解決信號間串色干擾問題的同時去除自發(fā)熒光背景。③定量組織切片圖像分析軟件，通過軟件的內(nèi)置組織類型識別算法，使系統(tǒng)自動定位目標組織區(qū)域，獲得精確至單細胞乃至細胞器水平的多參數(shù)定量結(jié)果，對組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)信息進行完整而全面的評價。

2 組織切片多光譜定量分析技術(shù)的優(yōu)勢

多標記流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）廣泛用于定量檢測血液中游離免疫細胞的特定亞群數(shù)量，但不能揭示實體瘤內(nèi)部和周圍的免疫細胞的空間關(guān)系和功能狀態(tài)，而這其中可能包含了預測患者對特定免疫療法的反應(yīng)所需的重要信息。免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）無法捕獲分析免疫細胞亞群所需的復雜多標記物表型，同時對3個以上標記物進行可視化或定量研究。石蠟切片的自發(fā)熒光現(xiàn)象會降低免疫熒光（immunofluorescence，IF）的靈敏度和定量可靠性[5]，由于顯色信號重疊，又會導致成像困難。

圖1 多重免疫熒光標記原理

圖2 多光譜拆分示意圖

多光譜成像克服了上述檢測手段的不足，大幅降低了福爾馬林固定石蠟包埋組織自體熒光的影響[5]。該技術(shù)將多標志物染色、多光譜成像和軟件定量算法分析匯聚結(jié)合[6]，支持石蠟切片中確定復雜的細胞表型、原位檢測免疫細胞和評估檢查點表達，同時對單個細胞上多種標記物進行定量計算，自動識別組織形態(tài)，分割不同的組織區(qū)域（如腫瘤和基質(zhì)），獲得以前方法無法企及的信息。

3 組織切片多光譜定量分析技術(shù)在腫瘤診斷及評價預后中的應(yīng)用

與傳統(tǒng)解剖病理學不同，多數(shù)研究人員希望在組織切片水平上獲得關(guān)于細胞蛋白表達的信息，以實現(xiàn)精確的定量分析[7]，包括目的細胞百分比計數(shù)、組織面積測量、標記物顯色強度或熒光強度的測量。如利用經(jīng)典IHC方法對淋巴瘤進行免疫分型時，有經(jīng)驗的血液病理學家可憑染色強度評分，雖具有臨床價值，但數(shù)據(jù)主觀性強，重復性有限[8]。由于沒有直觀的細胞定量數(shù)據(jù)，難以建立更加精確的診斷標準。Ng等[9]將多光譜定量分析技術(shù)用于血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤（angioimmunoblastic T-cell lymphoma，ATIL）的研究，用多重免疫熒光法標記TFH標志物（BCL6和PD1），經(jīng)定量組織切片圖像分析軟件分析直接精確得出ATIL患者組織切片的CD4+細胞中BCL6陽性細胞和PD1陽性細胞的百分比，及2種標志物同時表達的細胞百分比，經(jīng)多光譜定量分析軟件處理，將細胞表型分析結(jié)果圖形化，可精確診斷和判斷ATIL的預后。Chris[10]等將MSI與自動組織細胞識別軟件結(jié)合，準確定量Rab-B肝中Ki-67+增殖的肝細胞。圖像分析軟件自動學習組織細胞的形態(tài)，對其形態(tài)學進行評估，將組織圖像劃分為不同區(qū)域的能力可以極大地幫助病理學家判斷與鑒別復制的組織形態(tài)，減少人為錯誤[11]。

4 組織切片多光譜定量分析技術(shù)在腫瘤發(fā)生機制研究中的應(yīng)用

腫瘤微環(huán)境在腫瘤細胞的遠距離轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Mlecnik等[12]利用多光譜成像技術(shù)及其圖像處理軟件，并結(jié)合組織芯片，分析原發(fā)性結(jié)直腸癌（carcinomaofcolon and rectum，CRC）患者腫瘤組織中血管、淋巴管及腫瘤內(nèi)浸潤的淋巴細胞密度。他們用多熒光標記法在組織芯片上對CRC患者組織的血管和淋巴管標志物及多個免疫靶點（CD3/CD4/T-Bet/CD45RO/CD8/GZMB/CD57等）進行標記，依靠多光譜定量分析軟件自動將血管、淋巴管與其他組織區(qū)分，并由軟件直接計算血管面積/組織面積、淋巴管面積/組織面積的比率，不僅降低了組織芯片使用的成本，還提高了研究人員的分析效率，減少人為主觀判讀偏差。

Zaretsky等[13]利用多光譜定量分析技術(shù)研究接受抗PD-1（programmed death-1）療法的黑色素瘤患者復發(fā)的腫瘤細胞免疫逃逸機制，通過定量分析，可更加清楚及方便地分析出患者黑色素瘤樣本中 PD-L1（programmed death-ligand 1）的表達水平和細胞毒性T細胞（cytotoxic T cell，CTL）浸潤的水平和空間位置關(guān)系，在探索獲得性抵抗PD-1阻斷療法的機制中起到重要作用。

Nghiem等[14]用多重免疫熒光技術(shù)處理一位Ⅳ期Merkel細胞癌患者治療前后的活檢標本，以評價潘利珠單抗（Pembrolizumab）的治療效果。此方法避免多次切片，克服了多個免疫標志物不能在同一張切片上同時顯色的問題，得到背景干凈、信號清晰的數(shù)據(jù)圖片。治療前結(jié)果顯示在腫瘤-基質(zhì)界面處免疫浸潤最強烈，只有邊緣的腫瘤細胞為PD-L1陽性，僅靠近CD8+T細胞的腫瘤細胞才表達PD-L1。流式細胞術(shù)無法獲得這種復雜的位置信息。經(jīng)過抗體治療后，活檢標本顯示有彌漫性免疫吞噬細胞浸潤，無殘余的腫瘤細胞，并計算出陽性細胞比例。利用該結(jié)果，可遴選更適于免疫抗體治療的病人，提高抗體藥的療效。

在一項包含18種類型癌癥的研究中[15]，Huang等用多重熒光標記術(shù)標記了MET/HGF通路中的蛋白質(zhì)，推導出MET癌蛋白激活的模型。Stefanie等用抗-OX40與抗-CTLA-4和HER2疫苗聯(lián)合治療荷瘤小鼠[16]，他們用MSI技術(shù)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療后腫瘤部位出現(xiàn)強烈的腫瘤破壞效應(yīng)，伴有效應(yīng)T細胞浸潤腫瘤組織，證明聯(lián)合免疫療法能夠逆轉(zhuǎn)T細胞失能，提高小鼠存活率。Woods[17]等在炎癥和非炎癥狀態(tài)下，研究黑色素瘤細胞對逃逸T淋巴細胞殺傷作用的機制，利用多光譜定量分析技術(shù)同時得到明場和熒光圖像，在黑色素瘤活檢標本中顯示免疫蛋白酶體（immunoproteasome，IP）亞基和CD3+細胞的分布情況，發(fā)現(xiàn)二者的表達有明顯的相關(guān)性，并且在整個組織中免疫蛋白酶體的表達不均勻。

5 組織切片多光譜定量分析技術(shù)在其他疾病方面的應(yīng)用

在傳染性疾病方面，多光譜成像技術(shù)已被用于原位共定位檢測細胞因子與病毒。如丙型肝炎和隱匿性丙型肝炎病毒感染是一種與肝細胞癌和淋巴增生性疾病發(fā)病風險增加有關(guān)的病理類型，利用MSI可以證明丙型肝炎病毒是否促進淋巴細胞生長、侵入細胞免疫細胞并在細胞中傳播[18]。MSI也可與FISH結(jié)合，用于研究隱匿性乙型肝炎病毒感染如何誘導外周血淋巴細胞中可見的DNA損傷[19]，以及用于確定人類腫瘤中的溶瘤呼腸孤病毒的分布情況[20]。除此之外，組織切片多光譜定量分析技術(shù)在神經(jīng)科學研究[21]、移植研究[22]、心血管疾病研究中[23]也有所涉及。

6 結(jié)語

組織切片多光譜定量分析技術(shù)解決了長期阻礙實驗的技術(shù)難題：在明場圖像下，分割組織區(qū)域或細胞區(qū)室，支持多重染色單獨定量分析；在熒光圖像下，目標熒光與組織自發(fā)熒光得到有效區(qū)分，解決石蠟組織切片自發(fā)熒光干擾實驗的問題?？傊?，基于多光譜成像與組織切片圖像分析軟件相結(jié)合的組織切片多光譜定量分析技術(shù)是目前較新的組織原位細胞表型分析技術(shù)，將在生命科學基礎(chǔ)研究、腫瘤臨床診斷等方面發(fā)揮積極作用。最近國內(nèi)外也有少數(shù)科學家將該技術(shù)用于病毒學、病毒感染機制研究中。