李澤振，熊云，陳波

1.中國(guó)人民解放軍陸軍勤務(wù)學(xué)院 油料系，重慶 401331；

2.駐中國(guó)石油化工股份有限公司鎮(zhèn)海煉化分公司軍代室，浙江 寧波 315207

自20世紀(jì)30年代以來(lái)，已有許多關(guān)于噴氣燃料微生物污染的研究報(bào)道[1]。微生物的存在可能導(dǎo)致飛機(jī)燃油過(guò)濾器堵塞[2]、發(fā)動(dòng)機(jī)損壞[3]、油量表故障及儲(chǔ)油設(shè)備腐蝕[4]等問(wèn)題。因噴氣燃料儲(chǔ)存地點(diǎn)及使用條件[5]的不同，其中的微生物類(lèi)型也存在差異。真菌作為噴氣燃料中的主要污染微生物[6]，亦是噴氣燃料懸浮物問(wèn)題的重要原因[7]，一直以來(lái)都是噴氣燃料微生物污染領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。Ferrari等分析了350份噴氣燃料樣本，發(fā)現(xiàn)主要污染真菌是枝孢霉菌及曲霉菌[8]。楊浩等通過(guò)對(duì)我國(guó)不同地區(qū)的噴氣燃料油樣進(jìn)行微生物富集及測(cè)序分析，認(rèn)為噴氣燃料中的主要污染真菌為枝孢霉菌、青霉菌及曲霉菌等[9]。

ATP普遍存在于所有活的生物體中，被用來(lái)貯存和傳遞化學(xué)能[10]。通過(guò)測(cè)定樣品中的ATP含量，即可間接推算出樣品中的微生物數(shù)量。ATP生物發(fā)光法是一項(xiàng)通過(guò)檢測(cè)整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中的熒光強(qiáng)度來(lái)衡量ATP含量的技術(shù)。McElroy最先引入螢光素酶-ATP檢測(cè)法，其反應(yīng)機(jī)理為：在Mg2+存在下，螢火蟲(chóng)螢光素酶以ATP、O2為底物，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，發(fā)出光量子，其發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度成正比，因此可通過(guò)測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度來(lái)定量ATP濃度[11]。

目前對(duì)噴氣燃料微生物的研究主要集中在污染菌種的鑒定及治理措施方面[12]，噴氣燃料微生物污染程度的檢測(cè)主要通過(guò)傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法，而平板計(jì)數(shù)法存在耗時(shí)久、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，因此建立一種能快速檢測(cè)燃料中真菌污染程度的方法是有意義的。ATP生物發(fā)光法通過(guò)測(cè)量反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度來(lái)分析從微生物中提取得到的ATP數(shù)量，并間接反應(yīng)微生物數(shù)量，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在數(shù)分鐘內(nèi)完成。目前，ATP生物發(fā)光法已廣泛用于食品衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)控等方面[13]，而在噴氣燃料中微生物污染程度方面的研究還很少。我們研究了噴氣燃料主要污染真菌的最佳ATP提取方法及熒光素-螢光素酶反應(yīng)體系的篩選，初步建立了噴氣燃料真菌污染程度的檢測(cè)方法，并與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法相比較，在一定范圍內(nèi)可以代替平板計(jì)數(shù)法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌株枝孢霉菌（Amorphotheca resinae）、帚狀曲霉（Aspergillus penicillioides）、局限青霉（Penicilliμm restrictum）均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，由污染噴氣燃料中分離鑒定得到。試驗(yàn)用油為3號(hào)軍用噴氣燃料，由中國(guó)石油化工股份有限公司鎮(zhèn)海煉化分公司提供。

沙保培養(yǎng)基（葡萄糖4 g，蛋白胨1 g，瓊脂粉1.5 g溶于100 mL蒸餾水，121℃滅菌20 min）自制；CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、BAB（苯扎溴銨）、BAC（苯扎氯銨）、SDS（十二烷基硫酸鈉）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；標(biāo)準(zhǔn)ATP試劑購(gòu)于上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；3種熒光素-螢光素酶試劑分別購(gòu)于國(guó)內(nèi)3家公司。

單功能光吸收酶標(biāo)儀VersaMax（美國(guó)Molecular Devices Corporation）；HY-LiTE Jet A1 Fuel Test（德國(guó)Merck公司）；Tomy SX快速自動(dòng)高壓滅菌器（日本Tomy Digital Biology公司）；ESCO OptiMair垂直流超凈工作臺(tái)（新加坡藝思高科技有限公司）；SPX-150培養(yǎng)箱（北京厚慧實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 熒光素-螢光素酶體系的篩選

用ATP緩沖液將標(biāo)準(zhǔn)ATP試劑（10-2mol/L）分別稀釋至 10-8、3×10-9、10-9、3×10-10、10-10、3×10-11mol/L，取各濃度ATP溶液50 μL分別加入100 μL 3種不同的熒光素-螢光素酶體系中，測(cè)定發(fā)光值，重復(fù)3次取平均值。

1.3 模擬污染噴氣燃料

取在沙保培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后的3種試驗(yàn)真菌菌液各5 mL，分別加入500 mL提前用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后的噴氣燃料中，振蕩混勻后靜置3 d，作為3種真菌的模擬污染噴氣燃料。另取培養(yǎng)好的3種試驗(yàn)真菌菌液各2 mL，同時(shí)加入500 mL過(guò)濾后的噴氣燃料中，振蕩混勻后靜置3 d，作為混合菌的模擬污染噴氣燃料。

1.4 ATP裂解液的篩選

用自制提取液分別富集3種真菌的模擬污染噴氣燃料中的微生物，得到待測(cè)樣品。各取1 mL待測(cè)樣品分別加入1 mL 0.1%的BAC、BAB、CTAB及SDS溶液中，振蕩混勻后室溫作用1 min，取50 μL反應(yīng)液加入 100 μL 篩選出的熒光素-螢光素酶反應(yīng)體系中，測(cè)量發(fā)光值，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 BAC最佳裂解濃度確定

配置濃度分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%及0.25%的BAC裂解液，取3種真菌的模擬污染噴氣燃料提取后的待測(cè)樣品各1 mL，分別加入1 mL不同濃度的BAC溶液中，輕微振蕩混勻后于室溫作用 1 min，取 50 μL 反應(yīng)液加入 100 μL 熒光素-螢光素酶體系中，測(cè)量發(fā)光值。

1.6 BAC最佳裂解時(shí)間確定

取3種真菌的模擬污染噴氣燃料提取后的待測(cè)樣品各1 mL，分別加入1 mL 0.15%的BAC溶液中，輕微振蕩混勻后分別于室溫作用0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 min，之后分別取 50 μL反應(yīng)液加入100 μL熒光素-螢光素酶體系中，測(cè)量發(fā)光值。

1.7 ATP生物發(fā)光法與平板計(jì)數(shù)法的相關(guān)性

試驗(yàn)真菌分別接入沙保斜面培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)7 d后加入5 mL無(wú)菌水，輕輕刮下斜面上的孢子，振蕩過(guò)濾后得到孢子懸浮液，以血球板計(jì)數(shù)后4℃保存。用無(wú)菌水將真菌孢子懸浮液稀釋至不同梯度，分別用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法及ATP生物發(fā)光法檢測(cè)，分析2種方法的相關(guān)性。

1.8 ATP生物發(fā)光法檢測(cè)污染噴氣燃料

平行培養(yǎng)1.3中的3種真菌及混合菌的模擬污染噴氣燃料，每種各5組，并以無(wú)菌水代替菌液加入噴氣燃料中作為空白對(duì)照。首先用自制提取液提取微生物得到待測(cè)樣品，分別取1 mL待測(cè)樣品加入1 mL 0.15%的BAC中作用30 s后，立即取50 μL反應(yīng)液加入100 μL熒光素-螢光素酶體系中，測(cè)量發(fā)光值。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取均值，并通過(guò)測(cè)定各平行組的熒光值考察方法的重復(fù)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光素-螢光素酶體系的篩選結(jié)果

熒光素-螢光素酶體系的篩選結(jié)果如圖1所示。3種熒光體系中的C型熒光素-螢光素酶體系比A型相關(guān)性高，比B型線性范圍廣。通過(guò)回歸分析，得出C型一元線性方程為y=0.8080x+8.3884（R2=0.9654），即當(dāng) ATP 濃度為 10-8～3×10-11mol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度與ATP濃度有良好的線性關(guān)系，最終確定C型熒光素-螢光素酶體系。在實(shí)際使用情況下，因噴氣燃料中的微生物數(shù)量較少，而在富集微生物和ATP釋放過(guò)程中會(huì)有損耗，且存在人工操作和儀器檢測(cè)的誤差，所以需要更為靈敏穩(wěn)定且檢測(cè)限更低的熒光素-螢光素酶發(fā)光體系。

2.2 ATP裂解液篩選結(jié)果

各ATP裂解液對(duì)試驗(yàn)真菌的作用如表1所示。BAB、BAC及CTAB這3種表面活性劑裂解液效果較好，均能顯著提高熒光強(qiáng)度，其中BAC效果最好且毒性更低，使用方便，是ATP裂解液的良好選擇。

2.3 BAC最佳作用濃度確定

BAC的作用濃度篩選結(jié)果如圖2A所示，可以看出3種試驗(yàn)真菌的熒光強(qiáng)度隨BAC濃度的提高均是先增大后減小，當(dāng)BAC濃度為0.15%時(shí)熒光強(qiáng)度最大。這可能是因?yàn)檫m量濃度的BAC可以增加ATP的釋放效率，但過(guò)量的BAC會(huì)抑制螢光素酶的活性，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。確定BAC的最佳作用濃度為0.15%。

圖1 3種熒光素-螢光素酶體系的ATP濃度與發(fā)光強(qiáng)度關(guān)系

2.4 BAC最佳作用時(shí)間確定

BAC的時(shí)間篩選結(jié)果如圖2B所示，隨著裂解時(shí)間的增長(zhǎng)，3種試驗(yàn)真菌的熒光強(qiáng)度快速降低，這一方面是由熒光體系與ATP的反應(yīng)過(guò)程決定的，另一方面可能是因?yàn)槲灩馑孛傅姆€(wěn)定性不高而造成的。為了得到最大的熒光強(qiáng)度，確定BAC的最佳作用時(shí)間為30 s。

2.5 ATP生物發(fā)光法與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法的相關(guān)性

將3種試驗(yàn)真菌的孢子懸液稀釋至不同濃度梯度，分別采用ATP生物發(fā)光法及平板計(jì)數(shù)法計(jì)量其數(shù)量，結(jié)果如圖3所示。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，3種真菌的試驗(yàn)結(jié)果均線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均在0.96以上，說(shuō)明用ATP生物發(fā)光法檢測(cè)真菌數(shù)量與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法有良好的相關(guān)性。在實(shí)際應(yīng)用中，因?yàn)閲姎馊剂现械奈廴揪N復(fù)雜多樣，直接將熒光結(jié)果對(duì)應(yīng)菌落總數(shù)是困難的，而熒光結(jié)果可以反應(yīng)微生物數(shù)量，間接表征污染程度。

2.6 ATP生物發(fā)光法檢測(cè)污染噴氣燃料

用ATP生物發(fā)光法對(duì)5組平行培養(yǎng)的模擬污染噴氣燃料的檢測(cè)結(jié)果如表2。在各組的3次重復(fù)試驗(yàn)中，變異系數(shù)CV均小于3%，而各平行組的變異系數(shù)如表2所示，可見(jiàn)本方法對(duì)同一樣本的檢測(cè)重復(fù)性要高于平行組。推測(cè)是因?yàn)檎婢纳L(zhǎng)特性，難以確保各平行組內(nèi)的真菌數(shù)量一致，而混合菌的生長(zhǎng)情況更為復(fù)雜，所以其變異系數(shù)最高。在實(shí)際應(yīng)用本方法時(shí)，因?yàn)閲姎馊剂现形⑸锷L(zhǎng)情況復(fù)雜，難以將熒光結(jié)果對(duì)應(yīng)菌落數(shù)，所以可以直接利用熒光強(qiáng)度的大小來(lái)區(qū)分不同的污染程度。

表1 不同裂解液的ATP裂解效果

表2 ATP生物發(fā)光法測(cè)量結(jié)果

圖2 BAC作用濃度（A）和作用時(shí)間（B）對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

圖3 3種試驗(yàn)真菌的數(shù)量與熒光強(qiáng)度的關(guān)系

2.7 結(jié)論

篩選了國(guó)內(nèi)A、B、C共3種熒光素-螢光素酶發(fā)光體系，結(jié)果表明C產(chǎn)品在10-8～3×10-11mol/L范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與ATP濃度有良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限可達(dá)10-15mol ATP，可以用來(lái)檢測(cè)噴氣燃料中的真菌的污染程度。

對(duì)4種常用的真菌ATP裂解液進(jìn)行了篩選，并進(jìn)一步研究了最佳作用濃度及時(shí)間，結(jié)果表明0.15%的BAC作用30 s后可明顯提高熒光強(qiáng)度。

用ATP生物發(fā)光法及傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法對(duì)試驗(yàn)真菌的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明2種方法有較好的關(guān)聯(lián)性，在一定范圍內(nèi)，可以用ATP生物發(fā)光法檢測(cè)噴氣燃料中的真菌污染程度。

利用ATP生物發(fā)光法檢測(cè)噴氣燃料中真菌污染程度具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單且不需要大型儀器的優(yōu)點(diǎn)，可以確保現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。但在現(xiàn)階段還面臨重復(fù)性低、檢測(cè)限高等問(wèn)題。但其作為一種初步檢測(cè)方法，可以快速判定噴氣燃料中是否存在微生物污染情況及污染的嚴(yán)重程度，如果出現(xiàn)污染情況，可以對(duì)污染油料作后續(xù)檢測(cè)及治理，避免事故發(fā)生。