張曉菲,王麗,李勁濤,夏陽,吉元,盛望,韓曉東

北京工業(yè)大學(xué) a.生命科學(xué)與生物工程學(xué)院；b.固體微結(jié)構(gòu)與性能研究所；北京 100124

乳腺癌是女性發(fā)生率最高的惡性腫瘤，在我國其病死率呈逐年上升趨勢，僅次于肺癌，占女性惡性腫瘤第二位[1-2]。乳腺癌有多種亞型[3]，其中三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）均為陰性的一種特殊類型的乳腺癌，占乳腺癌的15%～20%[4]，缺乏有效的靶向治療手段，預(yù)后較差，死亡率較高。

表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）是HER/ErbB家族成員，定位于細(xì)胞膜上[5]，在許多惡性腫瘤中異常高表達(dá)。有研究報(bào)道，腫瘤細(xì)胞內(nèi)EGFR通過形成二聚體激活酪氨酸蛋白激酶并誘導(dǎo)下游蛋白磷酸化，從而啟動(dòng)下游信號通路，促進(jìn)并調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移[6]。EGFR在TNBC中的表達(dá)水平比其他亞型乳腺癌高，目前被認(rèn)為是TNBC防治的重要腫瘤靶點(diǎn)[7]。

近年來細(xì)胞原位單分子成像研究領(lǐng)域是交叉學(xué)科的研究熱點(diǎn)之一。2006年莊小威等[8]報(bào)道了基于單分子熒光檢測的超高分辨率成像方法，即隨機(jī)光學(xué)重建顯微法（STORM），基于光化學(xué)機(jī)制在實(shí)驗(yàn)室合成了超亮的可光控的染料及具有最佳性能的熒光蛋白。在此基礎(chǔ)上也發(fā)展了高分辨熒光成像，發(fā)展了單分子超高分辨率的方法。2015，Peckys等利用量子點(diǎn)對乳腺癌細(xì)胞表面的HER2進(jìn)行單分子研究，為單分子成像提供了豐富的理論依據(jù)[9]。

相比較于光學(xué)顯微鏡，電鏡用電子束作為激發(fā)光源，不受衍射極限的限制，具有納米級的分辨率。在此，我們利用EGFR特異的核酸適配體介導(dǎo)鏈接納米金顆粒，用環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察研究了三陰性乳腺癌細(xì)胞的二次電子像，利用電子顯微鏡的超分辨率在納米尺度對EGFR在該細(xì)胞表面的分布及聚集狀態(tài)進(jìn)行了成像分析研究。本研究為深入探討EGFR作用機(jī)制和開發(fā)評價(jià)相應(yīng)靶向藥物提供了新的可視化研究手段，也為腫瘤防治提供了新的技術(shù)思路。

1 材料與方法

1.1 材料

三陰性乳腺癌細(xì)胞MB-231細(xì)胞系購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；鏈霉親和素修飾的納米金顆粒由NANOCS公司合成；特異性結(jié)合EGFR的核酸適配體序列TGCCGTTTCTTCTCTTT CGCTTTTTTTGCTTTTGAGCATG[10]由生工生物工程股份有限公司合成；ITO導(dǎo)電玻璃購于上海聚笛玻璃公司。

1.2 MB-231細(xì)胞培養(yǎng)

在生物安全柜中將ITO導(dǎo)電玻璃置于75%酒精中浸泡30 min，紫外燈下照射30 min，放入12孔板中。將2×105/mL的MB-231細(xì)胞懸液鋪在有ITO導(dǎo)電玻璃的12孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入1 mL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用超純水清洗培養(yǎng)有MB-231細(xì)胞的ITO導(dǎo)電玻璃5次，晾干后將濃度為20 mol/L的生物素標(biāo)記的EGFR適配體室溫敷育在ITO導(dǎo)電玻璃上，于濕盒中敷育1 h，用超純水清洗干凈，晾干后將鏈霉親和素標(biāo)記的金顆粒用超純水稀釋至1/10，滴在細(xì)胞上，放入濕盒中敷育1 h，用超純水清洗ITO導(dǎo)電玻璃10次后晾干。

1.3 掃描電鏡表征

采用FEI公司Quanta 600環(huán)境掃描電鏡（environmental scanning electron microscope，ESEM）。ESEM成像模式[11]主要有二次電子（secondary electron，SE）像、背散射電子（backscattered electron，BSE）像。二次電子信號主要來自樣品表層5～10 nm深度[12]，能量較低（小于50 eV），二次電子像具有分辨率高、景深大、立體感強(qiáng)的特點(diǎn)，主要分析來自樣品表面的信息。背散射電子是被固體樣品中的原子核反彈回來的一部分入射電子，能量很高，有相當(dāng)部分接近入射電子能量。背散射電子像主要反映原子序數(shù)襯度。真空度模式有高真空、低真空、環(huán)境真空等3種模式，相應(yīng)樣品室壓力為10-2～10-5、13～133、133～2600 Pa。入射電子束輻照能量2～30 keV可調(diào)，入射電流10-8～10-9A，大倍數(shù)20～200 000′連續(xù)調(diào)節(jié)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用imageJ軟件，隨機(jī)選擇細(xì)胞不同位置的照片5張，分析統(tǒng)計(jì)蛋白表達(dá)數(shù)目，量化蛋白點(diǎn)，計(jì)算單體、二聚體、多聚體分布數(shù)目及比值，分析其分布特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 MB-231細(xì)胞在掃描電鏡下成像

MB-231細(xì)胞以單層細(xì)胞狀態(tài)貼壁生長在ITO導(dǎo)電玻璃上，呈貼壁的梭型或橢圓形，掃描電鏡表征，可以清晰地看到MB-231細(xì)胞的形態(tài)。圖1為三陰性乳腺癌細(xì)胞MB-231細(xì)胞在200 μm尺度下的二次電子像（BSE像），加速電壓為10 kV，spot size為3，可以清晰地看到細(xì)胞之間的胞間連絲。細(xì)胞生長狀態(tài)良好，可用于后續(xù)的高分辨成像研究。

2.2 MB-231細(xì)胞表面標(biāo)定EGFR單分子成像觀察

利用環(huán)境掃描電子顯微鏡對標(biāo)記金顆粒的三陰性乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行觀察。由于每個(gè)EGFR分子僅結(jié)合1個(gè)金顆粒，因此1個(gè)金顆粒代表1個(gè)EGFR單分子。圖2為三陰性乳腺癌細(xì)胞表面EGFR的掃描電鏡成像圖片?？梢郧逦赜^察到EGFR既可以單分子狀態(tài)存在，亦可以二聚體或多聚體（EGFR分子個(gè)數(shù)≥3）的形式存在。當(dāng)2個(gè)或多個(gè)EGFR分子間距離小于15 nm時(shí)，我們認(rèn)為其形成了二聚體或多聚體[13]。成像結(jié)果顯示無論是EGFR單體還是二聚體或多聚體，均隨機(jī)地分布在三陰性乳腺癌細(xì)胞表面，沒有發(fā)現(xiàn)某個(gè)區(qū)域以單分子為主或某個(gè)區(qū)域以二聚體或多聚體為主的現(xiàn)象。由于缺乏單分子的超分辨率研究手段，目前有關(guān)EGFR的報(bào)道更多集中在其可形成二聚體上面，但對其多聚體現(xiàn)象卻鮮見報(bào)道。從我們利用電鏡實(shí)現(xiàn)單分子納米尺度下的超分辨成像的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，常規(guī)培養(yǎng)條件下EGFR單體在三陰性乳腺癌細(xì)胞表面所占比例為36.98%，二聚體比例為12.22%，而多聚體比例高達(dá)50.80%。該結(jié)果提示EGFR在三陰性乳腺癌細(xì)胞表面主要以二聚體和多聚體的形式存在，而非單體形式，EGFR二聚體和多聚體比例總和達(dá)62%以上。如果EGFR僅簡單聚集成為二聚體即可激活其下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和抗凋亡的話，我們的結(jié)果顯示在三陰性乳腺癌細(xì)胞表面大于62%的EGFR分子是處于激活狀態(tài)并調(diào)控細(xì)胞的生長、遷移等基本功能。

3 討論

EGFR是相對分子質(zhì)量為170 000的跨膜受體酪氨酸激酶。目前研究認(rèn)為表皮細(xì)胞生長因子（epithelial growth factor，EGF）或轉(zhuǎn)化生長因子α（transforming growth factor-α，TGF-α）與 EGFR結(jié)合后，可以促使EGFR發(fā)生二聚體化，并通過改變其構(gòu)象誘導(dǎo)自身的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，磷酸化的EGFR形成并暴露Grb2結(jié)合位點(diǎn)并與Grb2分子結(jié)合，Grb2分子通過2個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域與SOS的鳥苷酸交換因子結(jié)合并進(jìn)一步活化Ras，激活Ras、MAPK和ERK等分子，最后ERK可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)參與調(diào)控細(xì)胞生長遷移等功能。因此，單分子的EGFR處于一種沒有酪氨酸激酶活性的狀態(tài)，且不具有啟動(dòng)調(diào)控或下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的功能。EGFR形成二聚體后可通過自身磷酸化啟動(dòng)下游信號通路并調(diào)控細(xì)胞狀態(tài)。本研究結(jié)果表明包括二聚體在內(nèi)的EGFR多聚體占其總數(shù)的比例超過了62%，這可以理解為在三陰性乳腺癌細(xì)胞表面絕大多數(shù)EGFR是處于聚體的激活狀態(tài)。本研究結(jié)果與EGFR信號通路在腫瘤細(xì)胞中異?；钴S，抗EGFR的小分子藥物或抗體藥物具有較好的抗腫瘤活性的結(jié)果相符。

圖1 三陰性乳腺癌細(xì)胞MB-231的掃描電鏡成像

圖2 EGFR標(biāo)定金顆粒在掃描電鏡下成像

EGFR多聚體現(xiàn)象在有關(guān)EGFR的研究中鮮見報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)EGFR二聚體比例在TNBC表面僅為12%左右，而其多聚體比例可達(dá)50.80%，說明超過50%的EGFR在TNBC表面以多聚體的形式存在。EGFR多聚體與二聚體在調(diào)控細(xì)胞的作用和功能上是否有區(qū)別及有何區(qū)別目前還未知。綜上，我們利用電鏡在納米尺度上定量分析了EGFR在TNBC表面的分布及聚集狀態(tài)，為進(jìn)一步在納米尺度的單分子水平全面揭示EGFR信號通路的調(diào)控機(jī)制及功能，研發(fā)高效的調(diào)控EGFR通路的抗腫瘤藥物提供了新的研究手段和策略。