劉瀟，李文桂,羅廣旭

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,Pa）是醫(yī)院內(nèi)感染的主要致病菌之一。Pa易定植且易耐藥，可導(dǎo)致囊性纖維化或免疫力低下等患者發(fā)生難治性感染[1-2]。2014年全國醫(yī)院感染橫斷面調(diào)查報告顯示，下呼吸道感染所分離的病原體中Pa數(shù)量（1573/7477株）居首位[3]。2016年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果顯示，廣泛耐藥的Pa菌株檢出率為2.1%，呈上升趨勢[4]。若Pa感染未得到及時治療或徹底治愈，轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥?，會使得治療難度加大。疫苗的應(yīng)用彌補(bǔ)了細(xì)菌的耐藥性和抗菌藥物長期大量使用產(chǎn)生的菌群失調(diào)等不足，為Pa的防治提供了新的思路[5]。

外膜蛋白Ⅰ（outer membrane proteinⅠ，OprⅠ）是一種結(jié)合在肽聚糖上的脂蛋白[6]，其脂質(zhì)尾是其有效發(fā)揮多種類型免疫應(yīng)答的重要成分之一[7-8]。Westritschnig 等[9-10]將 OprⅠ疫苗免疫健康志愿者，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)血清特異性IgG抗體升高，提示OprⅠ是一種有希望的疫苗分子。我們擬將OprⅠ基因插入原核表達(dá)載體pGEX-1λT，構(gòu)建pGEX-OprⅠ，再將其電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），研究該重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)，為Pa疫苗研制提供有價值的材料。

1 材料與方法

1.1 材料

Pa的PA01株由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院余加林教授惠贈；pGEX-1λT和大腸桿菌BL21（DE3）由本室保存。

DNA抽提試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購于上海生工公司；BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購于Fermentas公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購于北京鼎今生物科技公司；Pa感染的鼠血清、LB液體和固體培養(yǎng)基由本室保存。

恒溫?fù)u床購于日本三洋公司；高速離心機(jī)、電穿孔儀購于德國Eppendorf公司；PCR儀、凝膠成像分析儀、電泳儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 OprⅠ基因的擴(kuò)增及鑒定

根據(jù)GenBank中Pa的OprⅠ基因序列和pGEX-1λT 載體特點(diǎn)設(shè)計引物 P1（5′-GCGGATTC TGAGCAGCCACTCCAAAGAAACGAAGCT-3′，下劃線處為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）、P2（5′-GCGAATTCCT ATTACTTGCGGCTGGCTTTTTCC-3′，下劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），由上海生工公司合成。取Pa菌種PA01株加入LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)48～72 h至細(xì)菌濃度約為109/mL，10 000 r/min離心1 min，棄上清液，按照DNA抽提試劑盒說明書提取DNA。以Pa基因組DNA為模板，以P1和P2為引物，PCR擴(kuò)增OprⅠ片段。50 μL PCR反應(yīng)體系包括2×PCR Master 25 μL、引物各 2 μL、DNA 模板 3 μL、滅菌雙蒸水 18 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸2 min。取PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行12 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 重組質(zhì)粒pGEX-OprⅠ的構(gòu)建

將 BL21（pGEX-1λT）接種在氨芐青霉素（Amp）濃度為50 μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16～18 h，挑選單克隆菌落接入Amp濃度為50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48～72 h，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取pGEX-1λT。

OprⅠ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pGEX-1λT均經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切體系總體積均為 60 μL，包括 42 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物或載體、1.3 μLBamHⅠ、1.3 μLEcoRⅠ、6 μL 10×Tango緩沖液、9.4 μL滅菌雙蒸水。37℃水浴酶切2 h。按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書對酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化。

將OprⅠ基因片段與載體片段混勻（摩爾比5∶1），連接體系（20 μL）包括 OprⅠ基因片段 4μL、載體片段12 μL、10×T4DNA連接酶緩沖液2 μL、T4DNA連接酶2 μL。5000 r/min離心15 s，4℃連接過夜，70℃水浴10 min滅活連接酶。

按照高效感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒說明書制備感受態(tài)大腸桿菌 BL21（DE3）。取 80 μL 感受態(tài)菌液與20 μL連接產(chǎn)物充分混勻，冰浴1 min，轉(zhuǎn)移至電擊杯中。電穿孔（電穿孔參數(shù)：0.8～2.5 kV，5 ms/次，1～5次）結(jié)束后繼續(xù)冰浴5～10 min，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)管中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，取適量菌液劃線接種至含 Amp（50 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)72 h。

1.4 重組質(zhì)粒pGEX-OprⅠ的鑒定

挑選單克隆菌落接入含 Amp（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)48～72 h，收集菌體，抽提質(zhì)粒，用上述酶切體系進(jìn)行雙酶切鑒定。以抽提的質(zhì)粒為模板，按上述方法擴(kuò)增OprⅠ基因。

1.5 大腸桿菌BL21（pGEX-OprⅠ）的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

陽性重組菌振蕩培養(yǎng)至菌液D600nm值為0.5～0.8，取部分做對照，其余加入1 mmol/L的IPTG，分別在誘導(dǎo)后1、3、5、7、9、11和13 h收集菌體，與50 μL 1×蛋白加樣緩沖液混勻，煮沸5 min，分別取20 μL加樣進(jìn)行SDS-PAGE。

1.6 Western印跡鑒定

SDS-PAGE結(jié)束后，150 mA、2 h恒流電轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，用1∶100稀釋的Pa感染的鼠血清（一抗）室溫孵育2 h，用1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（二抗）室溫孵育2 h，用現(xiàn)配的二氨基聯(lián)苯胺顯色液避光反應(yīng)15～20 min進(jìn)行顯色并成像。

2 結(jié)果

2.1 OprⅠ抗原編碼基因的鑒定

以PA01株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，可獲得約194 bp的OprⅠ基因片段（圖1）。

圖1 OprⅠ抗原編碼基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

2.2 重組質(zhì)粒pGEX-OprⅠ的雙酶切鑒定

以pGEX-1λT空載體為對照，從具有Amp抗性的重組菌中提取重組質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切后產(chǎn)生約4947 bp的pGEX-1λT載體片段和194 bp的OprⅠ基因片段（圖2）。

圖2 pGEX-OprⅠ的雙酶切鑒定

2.3 重組質(zhì)粒pGEX-OprⅠ的PCR鑒定

從具有Amp抗性的重組菌中抽提質(zhì)粒，以此為模板，以P1和P2為引物進(jìn)行PCR，可擴(kuò)增出約194 bp的OprⅠ基因片段（圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒pGEX-OprⅠ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

2.4 大腸桿菌BL21（pGEX-OprⅠ）表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

IPTG誘導(dǎo)BL21（pGEX-OprⅠ）表達(dá)相對分子質(zhì)量（Mr）約32 000的GST-OprⅠ融合蛋白（GST的Mr約 26 000，OprⅠ的Mr約 6000）。凝膠成像分析結(jié)果提示蛋白表達(dá)量在IPTG誘導(dǎo)3～5 h時較高，融合蛋白約占菌體總蛋白的20%（圖4）。

圖4 重組菌BL21（pGEX-OprⅠ）表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.5 Western印跡鑒定

Pa感染的鼠血清可識別大腸桿菌BL21（pGEX-OprⅠ）表達(dá)的GST-OprⅠ蛋白，識別的條帶Mr約32 000，與預(yù)期相符（圖5）。

圖5 BL21（pGEX-OprⅠ）表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡鑒定

3 討論

Fruh等[11]以pITaq1為模板擴(kuò)增OprⅠ基因，將其克隆入pQE構(gòu)建pQE8-I，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15/pREP4，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Mr約8000的重組OprⅠ蛋白，Western印跡證實(shí)小鼠單克隆抗體（mAb）2A1可識別該重組OprⅠ蛋白，von Specht等[10]將此重組OprⅠ蛋白免疫健康志愿者可誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。Finke等[12-13]將OprⅠ基因克隆至pTaq獲得重組質(zhì)粒pITaq1，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)Mr約8000的重組OprⅠ蛋白，Western印跡提示表達(dá)的OprⅠ蛋白可與小鼠mAb結(jié)合，以純化的重組OprⅠ蛋白接種小鼠可誘導(dǎo)其產(chǎn)生抵抗Pa感染的保護(hù)力。陳春琳等[14]提取PA01株基因組DNA，PCR擴(kuò)增獲得252 bp的OprⅠ基因，與pET-32a連接獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)Mr約30 000的OprⅠ融合蛋白，Western印跡證實(shí)免疫鼠血清可識別該融合蛋白，純化的OprⅠ蛋白免疫昆明鼠可產(chǎn)生顯著的保護(hù)力。這些研究表明OprⅠ蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較好的保護(hù)性免疫應(yīng)答，在Pa疫苗的研究方面具有重要價值。

本研究采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌作為宿主菌具有遺傳背景清楚、可供選擇的高效表達(dá)載體多、目標(biāo)蛋白表達(dá)量較高、培養(yǎng)條件簡單且周期短和不易污染等優(yōu)點(diǎn)。BL21（DE3）是常用的蛋白酶基因缺陷株，可使目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性較其他表達(dá)菌株增強(qiáng)。pGEX-1λT源于pBR322，是一種以大腸桿菌為宿主菌的高效融合型表達(dá)載體，pGEX-1λT的多克隆位點(diǎn)上游有一個谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因和一個凝血蛋白酶切割位點(diǎn)的編碼序列，目標(biāo)基因插入后，產(chǎn)生的融合蛋白由3個序列構(gòu)成。GST在大腸桿菌中容易表達(dá)，與其構(gòu)成的融合蛋白具有較高的可溶性和酶活性。GST基因上游的tac啟動子由lacUV5的Pribnow序列與trp啟動子的-35序列拼接而成，其mRNA轉(zhuǎn)錄水平遠(yuǎn)高于lacUV5和trp啟動子，所有的tac啟動子都可被IPTG誘導(dǎo)進(jìn)而高效表達(dá)外源基因。近年來，眾多學(xué)者使用pGEX-1λT和BL21（DE3）研究目的基因的表達(dá)，張寧等[15]利用pGEX-1λT使日本血吸蟲Sj-14-3-3基因在BL21（DE3）中表達(dá)，張麗等[16]將日本血吸蟲Sj26GST基因插入 pGEX-1λT，導(dǎo)入 BL21（DE3）后可表達(dá)目的蛋白。本研究構(gòu)建了重組大腸桿菌BL21（pGEX-OprⅠ），其表達(dá)的融合蛋白可被Pa感染的鼠血清特異性識別，與上述研究[14-16]相似，提示OprⅠ基因可在BL21（DE3）中表達(dá)，且表達(dá)的蛋白具有抗原性。