王喆，王蕊 ，陳思涵，范穎，滿朝新，姜毓君,b

（東北農(nóng)業(yè)大學a.食品學院乳品科學教育部重點實驗室；b.國家乳業(yè)工程技術研究中心，哈爾濱150030）

0 引言

乳酸菌是對人體有著多種益生功能的微生物，同時也是組成先天性免疫系統(tǒng)重要的部分，在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)的過程中是不可缺少的[1]。乳桿菌作為重要的益生菌來源，主要是在腸黏膜上發(fā)揮其作用，所以其對腸上皮細胞的粘附能力是其發(fā)揮益生作用重要的一項標準[2-3]。益生乳桿菌通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群[4-5]，以及直接對固有免疫和適應性免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，以達到預防和治療相關疾病，調(diào)節(jié)免疫功能的效果[6-7]。本研究選擇了從西藏地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中分離得到的4株乳桿菌進行實驗，對其對腸上皮細胞的粘附能力研究比較，從中選出一株有較強粘附能力的植物乳桿菌，對其在動物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用進行研究，找到其在機體免疫功能方面的證據(jù)，為后續(xù)更科學地把這株植物乳桿菌應用于開發(fā)免疫調(diào)節(jié)相關乳制品提供相關依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株、細胞及動物

干酪乳桿菌TD 085，植物乳桿菌TD 109，植物乳桿菌TD 113，嗜酸乳桿菌TD 124，分離自西藏地區(qū)傳統(tǒng)乳制品。

人結腸癌細胞Caco-2，昆明系小白鼠。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

M RS培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖20.0 g，Tw een-80 1.0 m L，硫酸錳0.25 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g；蒸餾水定容至1 000m L，調(diào)節(jié)pH至5.8，121℃高壓滅菌15 min，4℃保存。

DM EM細胞培養(yǎng)液：高糖DM EM 900 m L，胎牛血清100 m L，鏈霉素100μg/m L，青霉素100 U/m L，0.22μm無菌濾器過濾，4℃保存。

RPM I1640完全培養(yǎng)液：RPM I1640培養(yǎng)液過濾除菌，使用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺200 mm ol/L，青霉素100 U/m L，鏈霉素100 ug/L，用無菌的1 m ol/L的HC l或1 m ol/L的N aOH調(diào)pH至7.0～7.2，4℃保存。

小鼠白介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子（TNF-α）檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

M TT、ConA、無菌Hank's液、磷酸鹽緩沖溶液（PBS），異丙醇，氫氧化鈉，鹽酸，氯化鈉，碳酸氫鈉，臺盼藍等。

1.1.3 儀器和設備

BCN 1360型生物潔凈工作臺，HF90型CO2培養(yǎng)箱，DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，低溫冷凍離心機，高壓蒸汽滅菌鍋，酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 菌體對細胞的黏附作用

1.2.1.1 Caco-2細胞的培養(yǎng)

Caco-2細胞在含有10%的胎牛血清、100 U/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素的高糖DM EM培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，在37℃質(zhì)量分數(shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)液，當細胞單層生長到覆蓋培養(yǎng)瓶表面80%左右時，用PBS洗滌細胞，0.25%胰酶消化，以1∶2的比例進行傳代后，然后繼續(xù)進行培養(yǎng)，傳4代左右進行粘附實驗。

1.2.1.2 乳桿菌的培養(yǎng)

分別將四株乳酸菌于MRS固體培養(yǎng)基上進行三區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)36～48 h后分別挑取單菌落培養(yǎng)于液體M RS培養(yǎng)基，12 h后，按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，傳3代后即為實驗菌株。

1.2.1.3 細胞與菌體的共培養(yǎng)

將Caco-2細胞以每孔1×106個的濃度接種于6孔板，連續(xù)培養(yǎng)至極化狀態(tài)（18～21 d），此時加入菌體共培養(yǎng)。離心后棄上清，將菌體用無菌PBS洗滌3次，轉速為8 000 r/m in，4℃離心5 min，將菌體重懸于PBS即為實驗所需菌體。將重懸好的菌體以108個/孔的量加入到六孔板中，每株菌做3個平行孔，在37℃質(zhì)量分數(shù)為5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)4 h。用保存在4℃的PBS將實驗組（乳桿菌作用）和對照組（無乳桿菌作用）的Caco-2細胞沖洗3次，將未粘附的菌體洗脫，隨后用胰酶消化收集細胞，進行稀釋涂布平板計數(shù)，計算菌體的黏附率。

1.2.2 免疫指標檢測

1.2.2.1 動物分組及給藥方法

本研究采用昆明系小鼠，體質(zhì)量20g±2g，分為對照組（灌服生理鹽水）、實驗組（低劑量、中劑量和高劑量）。將植物乳桿菌TD 109制備成菌數(shù)107，108和109m L-1的菌懸液，按1m L（每100 g體質(zhì)量），以表1設計方案灌服給各組小鼠，每日1次，灌胃期間自由取食，連續(xù)灌胃30 d。

1.2.2.2 臟器指數(shù)測定

在末次灌胃24 h后，稱量各組小鼠體質(zhì)量，然后將小鼠脫頸處死，摘取脾臟、胸腺，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，按如下公式計算臟器指數(shù)[8]，即

臟器指數(shù)=免疫器官質(zhì)量（m g）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.2.2.3 細胞因子測定

于末次灌胃后24 h摘眼球采集全血，將采集的全血放入4℃冰箱靜置過夜，3 000 r/m in離心3 min，分離血清于離心管中備用。本實驗采用的檢測方法是雙抗體夾心ABC-ELISA法，按照試劑盒說明書進行操作，繪制標注曲線，計算血清中IL-2，IFN-γ，TNF-α質(zhì)量濃度。

1.2.2.4 M TT活力測定

將小鼠斷頸處死后，無菌取脾臟，將脾臟200目篩網(wǎng)研磨后過濾，用除菌后的Hank's液洗2次，離心10 min（1 000 r/m in）。然后取1m L完全培養(yǎng)液將細胞懸浮于其中，用臺酚蘭染色，從而計數(shù)活細胞（應在95%以上），調(diào)整細胞濃度至3×106m L-1。于96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL的脾細胞懸液，每個樣本設10個重復孔，再加入終質(zhì)量濃度為5μg/m L的ConA溶液 150μL，并用含 10%胎牛血清的RPIM 1640作空白對照。置于質(zhì)量分數(shù)5%的CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，結束培養(yǎng)4 h前，每孔加入質(zhì)量濃度為5 m g/m L的M TT 50μL，繼續(xù)孵育4 h，棄掉上清液，每孔加入150μL DM SO，輕微振蕩，在酶標儀570 nm讀數(shù)，以空白對照孔矯正零點，結果以570 nm處的OD值表示[8]。

1.2.2.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS22.0處理，以均值±標準差（x±s）的形式表示，不同分組間比較采用單因素方差分析（one-way-ANOVA）的方法，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 粘附能力測定

細胞的培養(yǎng)如圖1和圖2所示。

表1 實驗分組及飼養(yǎng)方式

不同菌株黏附能力比較：乳桿菌主要在腸黏膜上發(fā)揮其益生功能，所以乳桿菌對腸上皮細胞的粘附能力是對其進行評價重要的一項標準，粘附能力高的菌株對免疫作用的發(fā)揮也有著促進的效果。由圖3可知，不同乳桿菌對Caco-2的粘附能力存在顯著差異，四株菌對細胞的粘附率分別為14.59%，18.63%，9.66%和3.71%。其中，植物乳桿菌TD 109的粘附率最高，與之前的研究[9-10]相比，具有較高的粘附率，因此選用植物乳桿菌TD 109來進行后續(xù)的研究。圖3中，數(shù)據(jù)柱形標注不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2.2 臟器指數(shù)測定

胸腺是免疫相關的中樞器官，直接影響著外周免疫器官的發(fā)育以及細胞及體液免疫功能[11]；脾臟中有豐富的淋巴細胞，其臟器指數(shù)也可以在一定程度上反映出機體免疫能力的強弱，所以選擇對小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)進行測定。由表2可以看出，與對照組相比，植物乳桿菌TD 109灌胃后的各組在胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)上均出現(xiàn)了統(tǒng)計學差異（P＜0.05），說明低劑量、中劑量以及高劑量的植物乳桿菌都對小鼠的免疫力起到提高的作用。低、中、高劑量的胸腺指數(shù)之間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），低劑量組的脾臟指數(shù)與高劑量組之間具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

2.3 細胞因子測定

細胞因子在動物機體的免疫應答過程中起著非常重要的作用，對小鼠的研究表明，乳酸菌可以影響小鼠血液中細胞因子的含量。對患有腫瘤疾病的小鼠進行干酪乳桿菌飼喂后，其體內(nèi)的IL-12和IFN-γ水平有所增加[12]，還有實驗證明，乳酸菌可以通過抑制INF-α等促炎細胞因子的產(chǎn)生來實現(xiàn)對機體的免疫調(diào)節(jié)[13-14]。本實驗選用了IL-2、IFN-γ、TN F-α三種細胞因子進行檢測，以反映機體的免疫功能。

由表3可知，灌服植物乳桿菌TD 109提高了小鼠體內(nèi)IFN-γ和IL-2的含量，且促進作用隨濃度增加而增強，高劑量組與低、中劑量相比有統(tǒng)計學差異，但低劑量和中劑量之間無統(tǒng)計學差異。TN F-α的含量在乳桿菌灌胃后得到降低，但各劑量間無統(tǒng)計學差異。

2.4 M TT活力測定

M TT是一種測定細胞相對活力的方法，可以用來間接反映活細胞的數(shù)量。表4顯示，植物乳桿菌TD 109可以增強脾細胞代謝M TT活力，與對照組比較，菌濃度為107，108和109m L-1的實驗組均顯現(xiàn)了顯著性差異，且增強作用隨多糖濃度的增加而增強，進一步反映出該株植物乳桿菌對機體的免疫調(diào)節(jié)作用。

表3 植物乳桿菌TD109對IL-2，IFN-γ，TNF-α的影響ng/m L

3 結論

本研究對選取的4株乳酸菌進行了黏附能力的比較，結果表明植物乳桿菌TD 109具有較強的黏附能力，可達到18.63%。在對小鼠臟器指數(shù)的測定結果中，與對照組相比較，低劑量、中劑量、高劑量組均有統(tǒng)計學差異，小鼠的免疫臟器發(fā)育得到了明顯的促進。以上結果證明，TD 109可以通過促進小鼠胸腺及脾臟等免疫器官的發(fā)育，起到提高免疫功能的作用[15-16]。在細胞因子方面，小鼠血清中的IL-2和IFN-γ質(zhì)量濃度，經(jīng)過乳桿菌灌胃處理后都得到了顯著的提高，腫瘤壞死因子TNF-α也出現(xiàn)了顯著的降低，同時，通過MTT含量的測定，進一步地證明了此株菌的免疫功能。

表2 植物乳桿菌TD109對小鼠臟器指數(shù)的影響 mg/g

圖2 達到極化狀態(tài)的Caco-2細胞（200×）

圖3 不同乳桿菌對Caco-2細胞的粘附率

表4 植物乳桿菌TD109對MTT活力的影響

圖1 Caco-2細胞的生長狀態(tài)

綜上所述，植物乳桿菌TD 109具有一定的免疫增強作用，為對植物乳桿菌TD 109免疫相關機制的研究提供理論依據(jù)。