陶紅苗， 單小云， 李旭升， 陳浩浩， 毛宇飛， 何忠平

(1. 金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 2. 金華市中心醫(yī)院， 3. 金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院， 浙江 金華 321000)

缺血性腦卒中是全球主要的致死及致殘疾病之一[1]，在有效時(shí)間窗內(nèi)恢復(fù)缺血腦組織的血液灌注是目前缺血性腦卒中的唯一有效治療策略。然而，血流再灌卻造成腦缺血再灌注損傷，極大地影響缺血性腦卒中的臨床治療。腦缺血損傷的病理機(jī)制尚未完全闡明，有證據(jù)表明細(xì)胞自噬可能在其中發(fā)揮了重要的作用[2-5]。細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞通過自噬溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)容物的過程。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)維持著低水平的自噬；當(dāng)受到營(yíng)養(yǎng)缺乏、低氧和炎癥等刺激后細(xì)胞內(nèi)自噬可被激活[6]。諸多文獻(xiàn)報(bào)道大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后自噬溶酶體途徑被激活，自噬通過降解損傷線粒體、清除炎癥物質(zhì)等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7,8]；但是，自噬溶酶體途徑的過度激活可能將胞漿物質(zhì)和細(xì)胞器“消化”掉，造成細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂和能量耗竭，引發(fā)細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡加重了缺血損傷[9]。自噬在腦缺血損傷過程中究竟發(fā)揮了什么樣的作用，目前結(jié)論不一。有學(xué)者認(rèn)為自噬如同一把雙刃劍，腦缺血不同時(shí)期的自噬對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸有截然不同的作用[8]。而且有研究表明，在缺血再灌注損傷中施加藥物、缺血后處理等調(diào)控因素可以有效減輕其損傷程度，而且調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞自噬水平是主要治療機(jī)制之一，提示自噬是一種潛在的腦缺血損傷治療靶點(diǎn)[9-14]。因此，了解自噬水平變化規(guī)律可以為臨床治療腦缺血再灌注損傷提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)通過建立局灶性大鼠腦缺血和腦缺血再灌注模型，在不同時(shí)間點(diǎn)分別采用Western印跡法測(cè)定大腦皮層腦組織中微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3，LC3-Ⅱ)的水平，并進(jìn)一步通過透射電鏡檢測(cè)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞自噬情況，探討局灶性腦缺血和缺血再灌注所誘導(dǎo)大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的自噬變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

普通級(jí)雄性健康SD大鼠60只，體重(250～280) g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2012-0002，動(dòng)物合格證號(hào)為0267760。

1.2 主要試劑及材料

栓線(北京沙東生物有限公司，2634-A4型)；LC3-Ⅱ抗體(ab128025，英國(guó)Abcam公司)；GAPDH(MAB5465，聯(lián)科生物)、山羊抗兔Ⅱ抗(GAR0072，聯(lián)科生物)。TECNAI 10 透射電鏡。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備

取健康雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組(n=10)、腦缺血和缺血/再灌注模型組(n=50)。大鼠稱重，腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠。Sham組僅單純暴露右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，不做其他任何處理。模型組大鼠采用Longa等[15]改良線栓法制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(right middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型：頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈；結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，用血管夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈近心端和頸內(nèi)動(dòng)脈；在頸外動(dòng)脈靠近頸總動(dòng)脈分叉處剪1小口，插入一特制線栓(其一端用硅膠包被)，松開頸內(nèi)動(dòng)脈上的血管夾，將線栓輕輕由頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至線栓堵塞大腦中動(dòng)脈的起始部，線栓插入長(zhǎng)度一般為18～20 mm，扎緊線栓，再松開頸總動(dòng)脈上的血管夾。模型組于缺血30 min、2 h和缺血2 h再灌注1 h、6 h、24 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)抽取10只大鼠：缺血30 min及2 h大鼠不拔出線栓，直接處死并取材；缺血2 h再灌注1 h、6 h、24 h組大鼠，于缺血2 h后拔出線栓(即開始再灌注)，再灌注1 h、6 h和24 h時(shí)處死大鼠并取材。各組大鼠模型如未能存活至預(yù)計(jì)時(shí)間點(diǎn)，則重新制作模型補(bǔ)足。大鼠蘇醒后，依據(jù)Zea longa 5分制標(biāo)準(zhǔn)(無神經(jīng)功能缺損癥狀、活動(dòng)正常者為0分；不能伸展對(duì)側(cè)前爪者為1分；爬行時(shí)出現(xiàn)向左轉(zhuǎn)圈者為2分；行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒者為3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失者為4分)，篩選出2分或3分的具有典型腦缺血癥狀的大鼠模型進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剔除其余動(dòng)物以保證入組動(dòng)物均造模成功。所有大鼠造模后均無死亡，造模成功率80%。

1.4 標(biāo)本的采集和保存

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組隨機(jī)抽取4只大鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉并處死大鼠，迅速斷頭取腦組織，去除嗅球、小腦和低位腦干，取右側(cè)大腦半球組織標(biāo)本，用于腦梗死體積測(cè)定。其余6只大鼠處死后迅速用預(yù)冷的生理鹽水及4%福爾馬林溶液(溶于生理鹽水)恒壓貫序體循環(huán)灌流固定，以梗死區(qū)腦組織為中心，分別取材并用于以下指標(biāo)檢測(cè)：取約2 mm厚的腦組織稱濕重后用于含水量檢測(cè)；另取小塊腦組織迅速放入液氮，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于Western印跡檢測(cè)；隨機(jī)選取3只大鼠，于海馬位置冠狀位切一塊腦組織浸入4%甲醛固定，用于病理學(xué)檢查，并切取1 mm3皮層組織浸入2.5%戊二醛固定，用于透射電鏡檢查。

1.5 TTC法檢測(cè)腦梗死體積

沿冠狀面將右側(cè)大腦半球切片，片厚約2 mm，迅速將腦片置于2%TTC-PBS中，37 ℃避光孵育30 min，不時(shí)翻動(dòng)腦片使之與染液均勻接觸。正常腦組織染成深紅色，梗死區(qū)為白色(不著色)。染色后棄去染液，將腦片放入4%甲醛中固定24 h，數(shù)碼相機(jī)拍照，將圖像輸入計(jì)算機(jī)，用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0計(jì)算腦梗死體積百分比。為減少由腦水腫產(chǎn)生的誤差，采用以下公式計(jì)算大腦梗死體積百分比(%)=(缺血對(duì)側(cè)半球體積一缺血側(cè)非梗死體積)/缺血對(duì)側(cè)半球體積×100%[16]。

1.6 干濕法測(cè)定腦組織的含水量

取病變側(cè)約2 mm厚的腦組織稱濕重，放入95 ℃烤箱內(nèi)烘干24 h至恒重后取出恢復(fù)到室溫，稱干重。腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。

1.7 腦組織的病理學(xué)觀察

將沿海馬位置冠狀位切取的腦組織浸入4%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、HE染色制片，觀察腦組織病理學(xué)變化。

1.8 Western印跡法檢測(cè)LC3-Ⅱ的蛋白質(zhì)水平

將腦組織稱重后剪碎勻漿，加入細(xì)胞裂解液裂解，離心，取上清采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，-80 ℃冰箱保存。取適量蛋白質(zhì)樣本按常規(guī)方法進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將凝膠上分離得到的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后分別用非標(biāo)記I抗(抗LC3-Ⅱ抗體)及Ⅱ抗(山羊抗兔IgG)對(duì)其進(jìn)行孵育、檢測(cè)。用Image J圖像分析軟件分析灰度值，以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值為其相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 透射電鏡觀察腦組織的自噬情況

取1 mm3皮層腦組織，置于2.5%戊二醛溶液中固定過夜。磷酸緩沖液沖洗后，用1%鋨酸固定1 h；梯度乙醇、丙酮脫水，純包埋劑包埋。將超薄(120 nm)切片經(jīng)鈾、鉛雙染色后上單孔銅網(wǎng)，透射電鏡下觀察自噬泡并拍照。自噬體和自噬溶酶體的判斷標(biāo)準(zhǔn)參考相關(guān)指南[17]：自噬體為雙層膜結(jié)構(gòu)(至少可見部分雙層膜結(jié)構(gòu))，內(nèi)含結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器；自噬溶酶體為單層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)含處于不同消化階段的細(xì)胞器或胞質(zhì)成分。由于有時(shí)很難嚴(yán)格區(qū)分自噬體和自噬溶酶體，經(jīng)常將二者統(tǒng)稱為自噬泡。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 腦梗死體積的動(dòng)態(tài)變化

缺血30 min大鼠無明顯腦梗死，再灌注1 h，6 h，24 h大鼠腦梗死體積隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，與Sham組相比，再灌注6 h，24 h大鼠腦梗死體積具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，圖1、表1)。

2.2 腦組織含水量的動(dòng)態(tài)變化

缺血30 min、2 h，缺血后再灌注1 h、6 h腦組織含水量呈逐漸增加趨勢(shì)，但與Sham組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。再灌注24 h腦組織含水量較Sham組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

Fig.1The representative images of the infarcts stained with TTC in each group were showed

a: Sham group; b: Isch 30 min group; c: Isch 2 h group; d: Repe 1 h group; e: Repe 6 h group; f: Repe 24 h group

GroupsInfarct size(n=4)Water content(n=6)Sham079.56±4.98Isch 30 min079.66±3.90Isch 2 h2.75±0.4480.49±4.47Repe 1 h4.70±0.5482.78±3.04Repe 6 h9.75±2.81**82.94±6.39Repe 24 h24.78±3.53**86.49±4.35*

*P<0.05,**P<0.01vssham group

2.3 HE染色觀察大鼠腦組織病理學(xué)的動(dòng)態(tài)改變

Sham組大鼠腦皮層區(qū)和海馬區(qū)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列致密規(guī)則，無明顯水腫、細(xì)胞變性及凋亡等改變。缺血30 min、缺血2 h時(shí)，大鼠大腦皮層均未見明顯病變，海馬區(qū)見少量神經(jīng)元細(xì)胞核皺縮、深染呈變性凋亡狀態(tài)。缺血后再灌注1 h、6 h時(shí)，大鼠腦皮層未見明顯病理改變，海馬區(qū)見較多神經(jīng)元細(xì)胞核皺縮、深染呈變性凋亡狀態(tài)。再灌注24 h時(shí)，大鼠腦皮層見組織水腫、疏松，部分細(xì)胞變性、凋亡，海馬區(qū)見大量神經(jīng)元細(xì)胞核皺縮、深染呈變性凋亡狀(圖2)。

Fig.2The dynamic changes of neurons in cortex and hippocampus after ischemia/reperfusion as determined by HE staining(×200)

a: Sham group; b: Isch 30 min group; c: Isch 2 h group; d: Repe 1 h group; e: Repe 6 h group; f: Repe 24 h group. The arrows in the picture refer to nucleus shrinkage, hyperchromatosis and apoptosis. The circle represents tissue edema and loose structure

2.4 Western blot法檢測(cè)MCAO大鼠大腦皮層LC3蛋白質(zhì)水平的動(dòng)態(tài)變化

與Sham組比較，缺血30 min大鼠大腦皮層LC3-Ⅱ/Ⅰ比值無明顯差異，缺血2 h該比值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。缺血再灌注1 h、6 h大鼠大腦皮層LC3-Ⅱ/Ⅰ比值雖較缺血2 h有所下降，但仍明顯高于Sham組(P<0.05)；缺血再灌注24 h大鼠大腦皮層LC3-Ⅱ/Ⅰ達(dá)到高峰0.43±0.06，明顯高于Sham組(P<0.01，圖3和表2)。

Fig.3The dynamic changes in expression level of LC3-Ⅱ protein in the rat brain cortex detected by Western blot

GroupsLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratioSham0.20±0.09Isch 30 min0.26±0.02Isch 2 h0.37±0.04**Repe 1 h0.32±0.06*Repe 6 h0.30±0.03*Repe 24 h0.43±0.06**

*P<0.05,**P<0.01vssham group

2.5 透射電鏡觀察大鼠腦皮層自噬的動(dòng)態(tài)變化

Sham組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布較均勻，線粒體脊線清晰，神經(jīng)髓鞘豐富，自噬不明顯。與Sham組相比，缺血30 min大鼠皮層神經(jīng)元染色質(zhì)有固縮，線粒體有輕度損傷，有1～2個(gè)自噬泡；缺血2 h細(xì)胞凋亡較明顯，可見較多的自噬泡。缺血/再灌注1 h、6 h時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡更明顯，自噬泡持續(xù)增多；缺血/再灌注24 h時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞邊界模糊接近壞死，自噬泡在各組別中最多(圖4)。

3 討論

研究表明，自噬是腦缺血過程中的重要細(xì)胞生物學(xué)事件，腦缺血過程中伴有細(xì)胞自噬發(fā)生，且缺血和缺血/再灌注過程中都伴有自噬激活，提示細(xì)胞自噬可能與腦缺血過程密切相關(guān)[2-5]。盡管自噬在腦缺血過程中的作用仍存在爭(zhēng)議，但最近的研究表明，腦缺血/再灌注過程中的細(xì)胞自噬通過清除損傷線粒體進(jìn)而發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用[8]。不僅如此，通過藥理學(xué)或者缺血后處理等方法調(diào)控缺血/再灌注過程中的細(xì)胞自噬，可減輕腦缺血損傷[10,18]。這些結(jié)果提示，自噬可能是一種抗腦缺血/再灌注損傷的藥物干預(yù)新靶點(diǎn)。然而，自噬是一種復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)過程，腦缺血/再灌注過程中自噬發(fā)生的時(shí)相特征尚不完全清楚。因此，了解缺血/再灌注過程中自噬的變化規(guī)律，對(duì)進(jìn)一步尋找自噬干預(yù)時(shí)間窗具有十分重要的意義。

Fig.4Observation of autophagy in the rat brain cortex by transmission electron microscopy. a: Sham group; b: Isch 30 min group; c: Isch 2 h group; d: Repe 1 h group; e: Repe 6 h group; f: Repe 24 h group. The arrows in the picture refer to autophagic vesicles, and the circle represents chromatin condensation

本研究采用的大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞-再灌注模型是一種常用的動(dòng)物局灶性腦梗死模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，再灌注6 h和24 h時(shí)大鼠腦梗死體積增加較明顯，再灌注24 h時(shí)腦組織含水量增加較明顯，見皮層組織水腫、疏松，部分細(xì)胞變性、凋亡，海馬區(qū)可見大量神經(jīng)元細(xì)胞核皺縮、深染呈變性凋亡狀。該結(jié)果與前人的發(fā)現(xiàn)一致，同時(shí)也證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃浴；谠撃Ｐ?，我們進(jìn)一步探討了缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)自噬的激活情況。

LC3是自噬標(biāo)志物。自噬泡成熟時(shí)，LC3-I轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-II(即自噬體膜型)，LC3-II/I比值的大小被廣泛用于評(píng)估自噬激活的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血誘導(dǎo)自噬激活的時(shí)間可能在30 min以上，該結(jié)果與之前的報(bào)道類似[19]。然而，缺血誘導(dǎo)的自噬并未因血流再灌注而終止，再灌注1 h、6 h時(shí)自噬持續(xù)升高，再灌注24 h達(dá)到高峰。該結(jié)果提示，缺血后再灌注同樣是誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬的一種重要應(yīng)激因素。該結(jié)果還提示，在缺血后再灌注過程中自噬可能存在著較長(zhǎng)的激活時(shí)相。透射電鏡是研究自噬最可靠的檢測(cè)手段，我們利用透射電鏡對(duì)梗死區(qū)周圍大腦皮層組織進(jìn)行了觀察，進(jìn)一步證實(shí)了上述現(xiàn)象。上述研究均發(fā)現(xiàn)，在局灶性腦缺血再灌注模型中大腦皮層缺血2 h神經(jīng)細(xì)胞自噬即明顯激活，再灌注1 h、6 h自噬均持續(xù)增高，再灌注24 h自噬達(dá)高峰，提示缺血和缺血再灌注過程中都伴有自噬激活。

在缺血過程中，組織低氧、酸化及能量供應(yīng)障礙都可能是導(dǎo)致自噬激活的因素，本研究發(fā)現(xiàn)自噬隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)而激活，提示自噬激活可能與病理損傷的程度呈正相關(guān)。然而，伴隨著血流再灌注過程，氧化應(yīng)激損傷是主要病理特征。有文獻(xiàn)報(bào)道，氧化應(yīng)激是激活自噬的重要途徑[6]。腦缺血后的再灌注過程伴隨著氧化應(yīng)激，在再灌注早期有大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成，對(duì)組織細(xì)胞造成氧化損傷，同時(shí)細(xì)胞通過多種抗氧化機(jī)制清除部分的過氧化物。隨著再灌注的進(jìn)行，這些半衰期較短的ROS可能通過超氧化物歧化酶的作用形成過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物，后者的半衰期較長(zhǎng)，造成組織的持續(xù)氧化損傷。不僅如此，而且細(xì)胞的抗氧化機(jī)制在再灌注早期已耗竭，會(huì)造成氧化應(yīng)激的第二次增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比缺血2 h組，缺血后再灌注過程造成的自噬激活呈現(xiàn)先降低、后升高的趨勢(shì)，于再灌注24 h達(dá)峰值，這可能是再灌注過程中氧化應(yīng)激導(dǎo)致自噬二次激活的原因。該結(jié)果提示，調(diào)控缺血再灌注后的氧化應(yīng)激可能是有效干預(yù)自噬的手段之一。

本研究未對(duì)再灌注24 h后的情況進(jìn)行觀察。但有學(xué)者[20]采用透射電鏡觀察到，腦缺血再灌注損傷后半暗帶神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)自噬體形成、溶酶體增多，并持續(xù)到5 d。提示自噬激活可能存在于腦缺血再灌注后的較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，這可能為缺血性腦損傷治療提供了一個(gè)具有更長(zhǎng)時(shí)間窗的治療策略。有研究利用永久性腦缺血大鼠模型發(fā)現(xiàn)，缺血1 h半暗帶自噬就開始激活，缺血5 h自噬達(dá)高峰，而缺血性腦卒中24 h時(shí)自噬活性明顯下降而凋亡激活，認(rèn)為可能發(fā)生了從自噬到凋亡的轉(zhuǎn)變[19]。這提示，在不同腦缺血大鼠模型中自噬激活的規(guī)律存在差異，在將自噬作為腦卒中治療靶點(diǎn)時(shí)，需要充分考慮到這一點(diǎn)。

綜上所述，本研究通過大鼠在體腦缺血和缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)大腦皮層缺血2 h神經(jīng)細(xì)胞自噬即明顯激活，缺血后再灌注1 h、6 h時(shí)自噬均持續(xù)增高，缺血后再灌注24 h時(shí)自噬達(dá)高峰，為自噬干預(yù)提供了理論依據(jù)。