王 繼， 周 越， 張 荷， 李文博， 黃 怡

(北京體育大學 運動人體科學學院， 北京 100084)

研究發(fā)現(xiàn)，在多種肌肉萎縮性疾病中，如惡病質(zhì)、長期糖皮質(zhì)激素治療和2型糖尿病等引起的肌萎縮，均伴有骨骼肌中肌肉生長抑素(myostatin)及相關(guān)蛋白表達上調(diào)[1]。Myostatin又稱生長分化因子8(growth differentiation factor 8，GDF-8)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族成員，是骨骼肌的強有力的負調(diào)控因子。Myostatin主要通過Smads ( mothers against decapentaplegic homologs)家族介導其下游的信號轉(zhuǎn)導。磷酸化的Smad2/3可與Smad4形成復合物而被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)，通過與DNA及其他核因子相互作用激活肌萎縮蛋白基因的表達。肌萎縮盒F蛋白(muscle atrophy F-boX，MAFbx/atrogin-1)是肌肉特異性泛素E3連接酶，在肌萎縮中表達并導致結(jié)構(gòu)蛋白和收縮蛋白降解、肌肉體積和質(zhì)量減小[2]。

體育運動能改善肌萎縮，但不同肌肉收縮形式不同，導致肌肉肥大的效應(yīng)不同，這似乎與蛋白質(zhì)分解系統(tǒng)的相關(guān)性更大[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，與向心運動相比，12周中等強度離心運動后，atrogin-1及其調(diào)節(jié)蛋白FOXO3A 的mRNA表達水平顯著降低，提示離心運動可能有更好的肌萎縮抑制效應(yīng)。但尚未見離心運動對2型糖尿病肌萎縮影響的報道。

本研究通過9周高脂飲食聯(lián)合STZ注射建立2型糖尿病大鼠模型，觀察4周離心耐力運動對2型糖尿病大鼠骨骼肌萎縮的影響及myostatin/Smad/atrogin-1信號通路在此過程中的作用。本研究旨在為離心耐力運動改善2型糖尿病肌萎縮進而改善糖代謝紊亂提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑及器材

Mercodia大鼠胰島素酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司(10-1250-01)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma公司(S0130)；一抗抗GDF-8/11和抗Smad3抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司(sc-398333，sc-101154)，Phospho-Smad3 (Ser423/425)購自Cell Signaling Technology公司(C25A9)，Anti-Fbx32購自Abcam公司(ab74023)；二抗(生物素標記羊抗兔IgG)及免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(SP-0023)；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。血糖儀購自強生(上海)醫(yī)療器材有限公司(穩(wěn)擇易血糖儀)，酶標儀及電泳裝置均購自Bio-Rad公司。

1.2 實驗動物及分組

39只6周齡雄性SD大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證號：SCXK/京2012-0001)，體重(214.1±7.7) g。分籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水。環(huán)境溫度20～24℃，相對濕度45%～55%，晝夜12 h～12 h循環(huán)照明。

隨機抽取15只大鼠組成普通飼料組(normal chow diet，NCD組，n=15)，普通飼料飼養(yǎng)9周；其余24只大鼠構(gòu)成高脂飼料組(high fat diet，HFD組，n=24)，給予高脂飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司，H10045；能量比：脂肪60%、碳水化合物20%、蛋白質(zhì)20%)飼養(yǎng)9周。高脂飼料組于飼養(yǎng)9周后間隔3 d注射2次STZ，單次劑量為25 mg/kg bw，普通飼料組腹腔注射相應(yīng)劑量的枸櫞酸鈉緩沖液。注射STZ后1周，高脂飼料組大鼠尾靜脈采血測定空腹血糖濃度。糖尿病成模標準：空腹血糖濃度≥11.1 mmol/L。剔除造模不成功的大鼠。1周后復查大鼠空腹血糖濃度，標準同上，再次剔除造模不成功大鼠，最終得到2型糖尿病(type 2 diabetic mellitus，T2DM)模型組大鼠20只，建模成功率為83.3%。

將普通飼料組大鼠隨機分為2組：對照組(C，n=6)和運動組(E，n=9)；將2型糖尿病模型組大鼠隨機分為2組：糖尿病對照組(D，n=8)和糖尿病運動組(DE，n=12)。

1.3 運動方案

本研究參照Armstrong離心運動方案[5]，參與實驗的所有大鼠在正式實驗前進行為期3 d的適應(yīng)性跑臺訓練：跑速16 m/min。第1天跑臺坡度0°，訓練時間5 min；第2天跑臺坡度-5°，訓練時間10 min；第3天跑臺坡度-5°，訓練時間30 min，第4、5天休息，第6天開始正式訓練。

運動方案：坡度-5°，跑速16 m/min，每次訓練時間60 min。每周訓練5 d，共4周。

1.4 血樣采集與測試

1.4.1 血液指標測試 注射STZ后，所有大鼠禁食12 h。然后取尾血，血糖儀測定空腹血糖濃度(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)；全血4℃靜置2 h后，3 000r/min離心10 min取血清，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測空腹血清胰島素(fasting serum insulin，F(xiàn)INS)水平，計算胰島素敏感性。胰島素抵抗指數(shù)(Homa insulin resistance index，HOMA-IR)=FINS(mU/L)×FBG(mmol/l)/22.5；胰島素敏感性指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)=1/FBG(mmol/L)×FINS(mU/L)。

1.4.2 葡萄糖耐量試驗 所有糖尿病大鼠腹腔注射葡萄糖作葡萄糖耐量試驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)：糖尿病大鼠禁食12 h，首先檢測尾靜脈空腹血糖，按照2 g/kg體重的劑量腹腔注射50%葡萄糖溶液， 30、60、120 min時分別于尾靜脈采血檢測血糖。以時間為橫坐標，血糖水平為縱坐標作圖，計算血糖曲線下面積(area under the curve of blood glucose，AUCBG)。4周運動干預后，取所有大鼠重復上述FINS、FBG和IPGTT測試。

1.5 骨骼肌樣本采集與測試

4周運動干預后，大鼠稱重。腹腔注射水合氯醛(濃度10 %，0.4 ml/100g bw)麻醉，腹主動脈取血；仔細分離比目魚肌，切成約0.5 cm×0.3 cm×0.3 cm的塊狀，放入盛有OCT的方盒中，于液氮預冷的異戊烷中固定，然后用錫紙包裹存放于-80℃冰箱中，以備部分用于切片，部分用于蛋白樣品制備。

1.5.1 免疫組化分析 制取比目魚肌冰凍切片，切片厚8 μm，置4℃預冷的4%多聚甲醛中室溫固定10 min，PBS(pH7.4)沖洗3次，每次5 min。甩干后用組化筆畫圈，以5%羊血清封閉20 min，甩干后加一抗抗Fbx32(1∶200)，放入濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。復溫10 min，PBS沖洗3次，每次5 min。甩干后加入二抗(生物素標記羊抗兔IgG，1∶300)室溫孵育40 min，PBS沖洗3次，每次5min。顯微鏡下觀察DAB顯色3～5 min，待出現(xiàn)棕色沉淀立即用流水沖洗10 min。蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化后流水沖洗10 min。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，數(shù)碼體視顯微鏡拍片。觀察肌萎縮蛋白(Atrogin-1)分布情況，分析肌纖維平均橫截面積。

1.5.2 Western blot蛋白半定量分析 取比目魚肌組織塊解凍后，稱重、剪碎、勻漿，加裂解液(1:10)4℃裂解30 min。離心取上清，BCA法蛋白定量，統(tǒng)一調(diào)整蛋白質(zhì)濃度，加樣品緩沖液，煮沸變性蛋白。按10 μl/孔上樣，SDS-PAGE分離(電泳90 V，30 min；120 V，60 min)，轉(zhuǎn)膜(200 mA，90 min)，5% BSA常溫封閉2 h。分別加入一抗：抗GAPDH抗體(1∶1 000)、抗肌生成抑制蛋白(myostatin，1∶100)抗體、抗Smad3抗體(1∶200)、抗p-Smad3抗體(1∶1 000)和抗Fbx32抗體(1∶1 000)，室溫孵育30 min后轉(zhuǎn)4℃過夜。室溫下用TBST洗10 min×3次，加入二抗(1∶3 000)，室溫孵育2 h，TBST洗10 min×3次。均勻涂抹發(fā)光液后，將膜置于凝膠成像儀中曝光、拍照，image J分析條帶灰度值，以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH灰度值的比值評價蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 高脂膳食聯(lián)合STZ注射對大鼠胰島素敏感性和糖耐量的影響

9周高脂膳食聯(lián)合STZ注射后，2型糖尿病模型組大鼠(HFD+STZ)空腹血糖>11.1 mmol/L，明顯高于對照組(P<0.01)；血清胰島素水平明顯低于對照組(P<0.01)，表明9周高脂膳食聯(lián)合STZ注射成功制備2型糖尿病大鼠模型(表1)。

與普通飼料組相比，2型糖尿病模型組大鼠胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR非常明顯下降(P<0.01)，胰島素敏感性指數(shù)ISI明顯下降(P=0.03)，血糖曲線下面積AUCBG明顯高于普通飼料組(P<0.01)。腹腔注射葡萄糖后120 min時，普通飼料組大鼠血糖基本恢復至基線水平，但2型糖尿病模型組大鼠血糖仍高于基線水平(圖1)。

Fig.1Effects of high fat diet combined with STZ injection on glucose tolerance in rats

NCD: Normal chow diet; T2DM: Type 2 diabetic mellitus

Tab. 1 Comparison of sensitivity and glucose tolerance index between two groups after STZ

FINS: Fasting serum insulin; FBG: Fasting blood glucose; HOMA-IR: Homa insulin resistance index; ISI: Insulin sensitivity index; AUCBG: Area under the curve of blood glucose; NCD: Normal chow diet; T2DM: Type 2 diabetic mellitus

*P<0.05,**P<0.01vsNCD group

2.2 4周離心運動對2型糖尿病大鼠胰島素敏感性和糖耐量的影響

4周離心運動后，與C組相比，E組FINS、HOMA-IR顯著降低(P<0.01，P=0.01)，F(xiàn)BG有降低趨勢(P=0.21)，ISI非常明顯地升高(P<0.01)，AUCBG無顯著變化(P=0.39)；與D組相比，DE組HOMA-IR和AUCBG顯著降低(P<0.01，P<0.01)，F(xiàn)INS和FBG有降低趨勢，ISI有升高趨勢，但均無統(tǒng)計學差異(P=0.17，P=0.12，P=0.23，表2 ，圖2)。

Tab. 2 Results of insulin sensitivity and glucose tolerance in each group after 4 weeks of eccentric

FINS: Fasting serum insulin; FBG: Fasting blood glucose; HOMA-IR: Homa insulin resistance index; ISI: Insulin sensitivity index; AUCBG: Area under the curve of blood glucose; C: Control group; E: Exercise group; D: Diabetic group; DE: Diabetic+exercise group

*P<0.05,**P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsD group

Fig.2Comparison of AUCBG among groups after 4 weeks of eccentric exercise

C: Control group; E: Exercise group; D: Diabetic group; DE: Diabetic+exercise group

2.3 4周離心運動對大鼠體重、比目魚肌相對重量和肌纖維橫截面積的影響

實驗4周后，與C組相比，D組體重、比目魚肌質(zhì)量/脛骨長和肌纖維橫截面積(cross-sectional area，CSA)非常明顯下降(P<0.01)。4周離心運動后，與C組相比，E組體重非常顯著下降，肌纖維橫截面積顯著增加(P<0.01)，比目魚肌質(zhì)量/脛骨長無明顯變化(P=0.41)；與D組相比，DE組體重無明顯變化(P=0.22)，比目魚肌質(zhì)量/脛骨長呈現(xiàn)上升趨勢(P=0.09)，肌纖維橫截面積顯著升高(P=0.03，表3)。

2.4 4周離心運動對大鼠比目魚肌atrogin-1的影響

4周離心運動后，免疫組化觀察肌萎縮情況。如圖3所示，C組和E組大鼠比目魚肌中atrogin-1表達較弱，C組偶見胞漿中有黃褐色沉淀(箭頭處)，E組黃褐色顆粒呈散在顆粒狀分布。D組大鼠比目魚肌中atrogin-1表達明顯高于C組和E組，表現(xiàn)為廣泛、大面積黃褐色沉淀；DE組胞漿中黃褐色沉淀呈散在斑塊狀分布，但顏色較D組略淺(圖3，見彩圖頁Ⅳ)。

GroupnBody weight(g)Soleus mass/tibia length(g/m)CSA(μm2)C6636.5±49.96.74±0.744032.8±415.7E9546.4±33.1**6.43±0.634762.9±509.9**D8462.7±57.6**5.21±0.14**3288.7±309.1**DE12448.7±30.15.90±0.883836.8±559.8#

C: Control group; E: Exercise group; D: Diabetic group; DE: Diabetic+exercise group; CSA: Cross-sectional area of muscle fiber

**P<0.01vsC group;#P<0.05vsD group

2.5 4周離心運動對大鼠比目魚肌myostatin/Smad3/atrogin-1信號通路的影響

Western blot結(jié)果顯示：與C組相比，D組大鼠比目魚肌myostatin、Smad3、p-Smad3和atrogin-1表達升高非常明顯(P<0.01)。4周離心運動后，與C組相比，E組大鼠比目魚肌myostatin、p-Smad3和atrogin-1蛋白表達顯著降低(P<0.01，P<0.01，P=0.02)，Smad3表達無明顯差異(P=0.55)；與D組相比，DE組大鼠比目魚肌myostatin、p-Smad3和atrogin-1蛋白表達顯著降低(P=0.03，P<0.01，P=0.02)，Smad3表達無明顯差異(P=0.27，圖4)。

3 討論

3.1 4周離心運動改善2型糖尿病大鼠糖代謝障礙

2型糖尿病與肥胖、胰島素抵抗、胰島β細胞功能和數(shù)量缺陷密切相關(guān)。這些代謝紊亂嚴重影響胰島素對葡萄糖、脂肪和蛋白代謝的調(diào)節(jié)作用，最終促使2型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。符合2型糖尿病特征的動物模型是探尋控制和治療2型糖尿病的重要工具，其中包括遺傳性自發(fā)性糖尿病模型和實驗性非自發(fā)性糖尿病模型。高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)注射構(gòu)建的2型糖尿病模型是最常見的非自發(fā)性糖尿病模型。本研究通過9周高脂飼料飼養(yǎng)聯(lián)合STZ注射構(gòu)建2型糖尿病模型。與對照組相比，模型組大鼠血糖濃度非常顯著升高，血清胰島素含量顯著降低，穩(wěn)態(tài)模式胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)非常顯著降低，胰島素敏感性指數(shù)(ISI)顯著降低；腹腔注射糖耐量實驗(IPGTT)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血糖曲線下面積(AUCBG)非常顯著高于對照組，提示模型組大鼠存在嚴重的葡萄糖利用障礙。

Fig.2Expression of myostatin/Smad3/atrogin-1 signaling pathway protein in soleus muscle of each group after 4 week experiment

C: Control group; E: Exercise group; D: Diabetic group; DE: Diabetic+exercise group

*P<0.05,**P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsD group

在2型糖尿病不同類型的運動療法中，以有氧運動療法種類最多，操作也較方便。有氧運動(健步走、游泳、太極拳等)能在不同程度上改善2型糖尿病的糖、脂代謝障礙及相關(guān)并發(fā)癥[6,7]。但在針對2型糖尿病人群的運動處方中，仍強調(diào)多種運動方式相結(jié)合的重要性[8]。不習慣的離心收縮誘導損傷進而降低骨骼肌中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter 4, GLUT4)的水平，是導致一過性胰島素抵抗的重要原因[9,10]；但規(guī)律的離心耐力運動卻能對增強葡萄糖耐量產(chǎn)生積極作用[11]。本研究顯示，4周離心耐力運動雖然對2型糖尿病大鼠血清胰島素無明顯影響，但能在一定程度上降低空腹血糖，最終降低HOMA-IR和AUCBG、升高ISI。這可能與離心耐力運動提高骨骼肌質(zhì)量有關(guān)。Robin[12]研究發(fā)現(xiàn)，與單純有氧運動相比，有氧聯(lián)合離心運動能明顯改善2型糖尿病患者身體質(zhì)量指數(shù)，提高大腿肌肉質(zhì)量，這將直接提高患者基礎(chǔ)代謝率和運動表現(xiàn)，對改善2型糖尿病、提高患者生活質(zhì)量至關(guān)重要。

3.2 4周離心運動對2型糖尿病肌萎縮的改善作用

研究發(fā)現(xiàn)，與無糖尿病老年人相比，老年糖尿病患者肌肉質(zhì)量每年約降低26%，肌肉力量約降低33%[13]。骨骼肌負責全身約80%葡萄糖的攝取，其質(zhì)量下降將導致骨骼肌容量降低、胰島素敏感性下降，外周組織處理血糖的能力隨之減弱，進一步加快了2型糖尿病的進展。本研究顯示，2型糖尿病大鼠比目魚肌質(zhì)量/脛骨長比值顯著低于正常大鼠，肌纖維平均橫截面積(CSA)顯著降低，表明2型糖尿病大鼠骨骼肌明顯萎縮。而4周離心耐力運動能顯著提高骨骼肌平均CSA，改善2型糖尿病導致的骨骼肌萎縮。

離心運動可作用于肌細胞膜和細胞外基質(zhì)，使其受到較大刺激進而產(chǎn)生適應(yīng)性肌肉肥大，在改善肌萎縮方面有重要作用[14,15]。規(guī)律的中等強度運動導致骨骼肌中GLUT4含量和活性增加是運動降低胰島素抵抗，改善2型糖尿病糖、脂代謝障礙的重要原因[16]。其中骨骼肌容量增加是GLUT4含量增加的重要原因。Stefanetti[4]研究發(fā)現(xiàn)，與向心運動相比，12周中等強度離心運動后，atrogin-1及其調(diào)節(jié)蛋白FOXO3A 的mRNA表達水平顯著降低,提示離心運動增加骨骼肌容量、抑制肌萎縮效應(yīng)可能與蛋白分解系統(tǒng)有關(guān)。

3.3 Myostatin信號通路在肌萎縮改善中的作用

進一步研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病導致肌萎縮的分子機制可能與myostatin及其下游信號蛋白激活有關(guān)。骨骼肌能以自分泌/旁分泌的形式產(chǎn)生myostatin，成熟的myostatin二聚體-C端主要通過結(jié)合到Ⅱ型受體ActRⅡB和ActRⅡA ( ActRⅡB比ActRⅡA更容易結(jié)合)上，Ⅱ型受體活化后可磷酸化激活Ⅰ型受體(ALK4和ALK5)，進而使Smads( mothers against decapentaplegic homologs) 磷酸化。Smad3處于myostatin下游，磷酸化的Smad3可與Smad4形成復合物而轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)，通過與DNA及其他核因子相互作用激活肌萎縮蛋白基因的表達。肌肉環(huán)狀指蛋白1(muscle rING finger 1，MuRF1)和atrogin-1是兩個肌肉特異性泛素蛋白E3連接酶，參與底物識別并與靶蛋白序列特異性結(jié)合或降解決定子，從而調(diào)節(jié)靶蛋白的降解序列與速率。

在健康的肌肉中，受損或未折疊蛋白質(zhì)的分解是維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素。在2型糖尿病的發(fā)展過程中，蛋白質(zhì)分解途徑的持續(xù)激活增高收縮蛋白的降解率，導致蛋白質(zhì)凈損失增多，最終加劇肌萎縮[17]。本研究顯示，2型糖尿病大鼠比目魚肌中myostatin、Smad3、p-Smad3和atrogin-1蛋白表達水平均顯著高于對照組大鼠，而4周離心耐力運動能降低正常大鼠和2型糖尿病大鼠比目魚肌中myostatin、p-Smad3和atrogin-1的水平。

有報道[18]，pSmad2/3上調(diào)與MuRF1的表達相互獨立，但與atrogin-1的表達成正相關(guān)，提示atrogin-1可作為myostatin/Smad下游重要的基因表達產(chǎn)物參與肌萎縮調(diào)控。此外，atrogin-1還可作用于真核生物翻譯起始因子3亞基F(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit F，eIF3-f)、MyoD和myogenin等，降低其活性，從而抑制骨骼肌纖維合成與再生[19]。在本研究中，運動能誘導myostatin及其下游蛋白表達下降，但2型糖尿病運動組大鼠myostatin、p-Smad3和atrogin-1表達仍遠高于對照組大鼠，提示4周離心運動雖能抑制2型糖尿病大鼠肌萎縮相關(guān)蛋白表達，但尚不能使其恢復到正常大鼠水平。單純離心耐力運動干預能在一定程度上抑制2型糖尿病伴隨的肌萎縮，進而控制2型糖尿病進程，而myostatin信號通路抑制劑或許能成為改善2型糖尿病患者骨骼肌萎縮進而改善及其代謝障礙的重要靶點。

綜上所述，本研究通過高脂膳食聯(lián)合STZ注射成功建立2型糖尿病大鼠模型。模型組大鼠胰島素敏感性下降，葡萄糖利用嚴重障礙，同時伴有明顯的骨骼肌萎縮。其中myostatin/Smad3/atrogin-1信號通路上調(diào)是導致2型糖尿病肌萎縮的重要原因；而4周離心耐力運動可下調(diào)myostatin、p-Smad3和atrogin-1表達，這可能是離心耐力運動抑制肌萎縮，提高骨骼肌容量，進而改善2型糖尿病代謝障礙、提高胰島素敏感性的重要機制之一。