李 潔， 談文博， 王 艷

(西北師范大學(xué)體育學(xué)院, 甘肅 蘭州 730070)

研究發(fā)現(xiàn)，衰老與肌肉質(zhì)量和肌肉功能的下降有關(guān)[1]。身體活動在抵抗與衰老相關(guān)的生理衰退中起重要作用，保持足夠水平的身體活動可使壽命增加和降低代謝疾病以及其他慢性疾病的風(fēng)險[2]。定期有氧運(yùn)動可以通過在線粒體水平的有益效果來增加健康的生命預(yù)期并延長壽命[3]。長時間有氧運(yùn)動訓(xùn)練可以降低老年大鼠心肌線粒體DNA含量，增加線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體I、Ⅳ活性，延緩衰老過程中線粒體功能的退行性變化[4]。本實驗旨在通過觀察有氧運(yùn)動對衰老大鼠骨骼肌線粒體脂質(zhì)過氧化水平、抗氧化能力、三羧酸循環(huán)及呼吸鏈功能的影響，探討有氧運(yùn)動延緩衰老的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雌性健康Wistar大鼠，2月齡10只，12月齡20只，由甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證為SCXK(甘)2011-001，常規(guī)飼養(yǎng)。將12月齡的雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為老年安靜組(aged control group,AC,n=10)及老年運(yùn)動組(aged exercise group,AE,n=10)；2月齡的雌性Wistar大鼠為青年安靜組(young control group,YC,n=10)。

1.2 訓(xùn)練方案

所有大鼠在DSPT-202型跑臺(中國杭州錢江科工貿(mào)公司)上進(jìn)行每天1次、為期1周的適應(yīng)性運(yùn)動(坡度為0°，速度8.2 m/min、運(yùn)動時間5 min)。正式實驗時，運(yùn)動組大鼠進(jìn)行坡度為5°，速度為15.2 m/min，運(yùn)動時間第1天為15 min、第2天為30 min、從第3天開始為45 min，每周6 d，共12周[5]。安靜組大鼠進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 取材及線粒體制備

12周運(yùn)動訓(xùn)練結(jié)束后，按0.3 ml/100 g體重腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠。將大鼠斷頭處死，于冰盤上迅速取出腓腸肌，置于液氮中冷凍，-20 ℃低溫保存待用。按文獻(xiàn)[6]方法勻漿并提取腓腸肌線粒體，線粒體提取在Universal 320R臺式高速冷凍離心機(jī)(德國)上進(jìn)行。

1.4 測試的指標(biāo)及方法

1.4.1 線粒體抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化物含量的測定 按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書，在UVmimi-1240島津紫外可見光分光光度計(日本島津精密科學(xué)儀器有限公司)上測定錳-超氧化物歧化酶(Mn2+-superoxide dismutase, Mn2+-SOD)、谷光甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性及丙二醛(melondialdehyde, MDA)含量。

1.4.2 線粒體三羧酸循環(huán)限速酶及呼吸鏈酶復(fù)合體活性的測定 應(yīng)用雙抗體夾心法，嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書，在LA Labsystems Multiskan MS酶標(biāo)儀(芬蘭)上測定檸檬酸合酶(citrate synthase, CS)、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, ICD)、α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體(α-ketoglutarate dehydrogenase complex, α-KGDHC)活性及呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ(respiratory chain complexⅠ～Ⅳ, RCCⅠ～Ⅳ)活性。

1.4.3 蛋白質(zhì)濃度測定 以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，考馬斯亮藍(lán)G-250法測定。牛血清白蛋白及考馬斯亮藍(lán)為Sigma公司產(chǎn)品。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨骼肌線粒體中蛋白質(zhì)含量

提取的各組大鼠骨骼肌線粒體的蛋白質(zhì)含量分別為(μg/ml)：YC組599.42，AC 組581.91，AE組 609.78。

2.2 各組大鼠骨骼肌線粒體自由基代謝相關(guān)指標(biāo)的比較

與YC組相比，AC組SOD活性顯著升高(P<0.05)，升高26.00%，GSH-Px活性下降3.89%，但無顯著性差異，MDA含量顯著上升(P<0.05)，上升24.26%；AE組SOD和GSH-Px活性均顯著升高，分別升高54.94%(P<0.01)和28.61%(P<0.05)，MDA含量顯著上升(P<0.05)，上升12.43%。與AC組相比，AE組SOD及GSH-Px活性均顯著升高(P<0.05)，分別升高22.97%和33.81%，MDA含量顯著下降(P<0.05)，下降9.52%(表1)。

CroupSOD(U/mg prot)GSH-Px(U/mg prot)MDA(nmol/mg prot)YC5.46±1.4515.17±3.891.69±0.34AC6.88±1.43*14.58±3.502.10±0.45*AE8.46±1.66**#19.51±4.51**1.90±0.36**

YC: Young control group; AC: Aged control group; AE: Aged exercise group

*P<0.05,**P<0.01vsYC group;#P<0.05vsAC group

2.3 各組大鼠骨骼肌線粒體三羧酸循環(huán)限速酶活性的比較

與YC組相比，AC組CS和α-KGDHC活性均顯著下降(P<0.05)，分別下降4.22%和3.83%，ICD活性下降1.03%，但無顯著性差異。AE組CS、ICD和α-KGDHC活性均顯著上升(P<0.01)，分別上升9.37%、14.05%和15.02%。與AC組相比，AE組 CS、ICD和α-KGDHC活性均顯著上升(P<0.01)，分別上升14.18%、15.24%和19.61% (表2)。

GroupCSICDα-KGDHCYC650.96±48.63182.32±22.3188.68±12.24AC623.49±46.54*180.44±20.1585.28±10.95*AE711.93±54.89**##207.94±26.73**##102.00±16.87**##

CS: Citrate synthase; ICD: Isocitrate dehydrogenase; α-KGDHC: α-Ketoglutarate dehydrogenase complex

*P<0.05,**P<0.01vsYC group；##P<0.01vsAC group

2.4 各組大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性的比較

與YC組相比，AC組RCCⅠ、RCCⅡ和RCCⅣ活性均顯著下降(P<0.05)，分別下降5.44%、8.51%和6.99%，RCCⅢ活性顯著升高(P<0.05)，升高5.22%；AE組 RCCⅠ～Ⅳ活性均顯著升高(P<0.01)，分別升高12.46%、14.41%、14.10%和14.14%。與AC組相比，AE組 RCCⅠ～Ⅳ活性均顯著升高(P<0.01)，分別升高18.93%、25.05%、8.44%和22.72%(表3)。

3 討論

3.1 有氧運(yùn)動對衰老大鼠骨骼肌線粒體脂質(zhì)過氧化及抗氧化能力的影響

研究發(fā)現(xiàn)，許多與年齡相關(guān)的疾病中都存在大分子氧化損傷的累積現(xiàn)象[7]，線粒體氧化應(yīng)激在衰老和健康狀況中具有中心作用[8]，在老化的骨骼肌線粒體中活性氧簇(ROS)增加[9-10]。本研究結(jié)果顯示，老年大鼠骨骼肌線粒體中脂質(zhì)過氧化水平顯著升高，這可能與隨著年齡的增長，線粒體電子傳遞鏈組分含量下降、內(nèi)膜親水性增加及蛋白質(zhì)損傷等因素，使電子不能按順序轉(zhuǎn)移，電子漏增多，導(dǎo)致在線粒體內(nèi)膜生成O2-·增加有關(guān)。此外，脂類對過氧化敏感性的增高可能也是衰老時線粒體脂質(zhì)過氧化水平升高的原因。本研究結(jié)果還顯示，老年大鼠骨骼肌線粒體抗氧化酶活性變化不一，SOD活性顯著升高，GSH-Px活性無顯著性變化，脂質(zhì)過氧化水平升高。這可能是由于隨著年齡的增長，為抵御ROS的增加，機(jī)體應(yīng)激性的增加抗氧化酶的活性，但由于抗氧化酶活性變化不一及增加的幅度無法完全抵消ROS的增加，最終導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化水平升高。其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

有研究報道，采用維持衰老骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)的方法后，線粒體ROS很少增加[11]，在活動活躍的老人中未觀察到骨骼肌線粒體ROS增加[12]。本研究觀察到，與不運(yùn)動同齡大鼠比較，12周有氧運(yùn)動可使老年大鼠骨骼肌線粒體抗氧化酶活性顯著增高，脂質(zhì)過氧化水平顯著降低，說明老年個體仍保持著線粒體抗氧化功能的適應(yīng)能力，這可能與運(yùn)動促使ROS產(chǎn)生增多有關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，老年運(yùn)動大鼠骨骼肌線粒體抗氧化酶活性與脂質(zhì)過氧化水平均顯著高于青年安靜大鼠，這可能是由于年輕大鼠骨骼肌抗氧化酶活性與ROS相匹配，使氧化和抗氧化處于平衡狀態(tài)。而衰老使骨骼肌ROS增多，骨骼肌應(yīng)激性增加抗氧化酶活性，復(fù)合長期的有氧運(yùn)動可進(jìn)一步提高衰老骨骼肌線粒體抗氧化酶的功能，在一定程度上降低了脂質(zhì)過氧化程度，但抗氧化酶活性的提高幅度無法完全抵消由于衰老和運(yùn)動增加的ROS量，氧化和抗氧化處于不平衡狀態(tài)，最終使脂質(zhì)過氧化水平升高。還有研究表明[14]，6周負(fù)重訓(xùn)練可有效緩解D-半乳糖大鼠骨骼肌的衰老進(jìn)程，其機(jī)制可能與減輕骨骼肌氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

3.2 有氧運(yùn)動對衰老大鼠骨骼肌線粒體三羧酸循環(huán)限速酶活性的影響

研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠骨骼肌有氧代謝酶活性明顯下降，10周跑臺運(yùn)動訓(xùn)練后有氧代謝酶活性顯著增加[15]。本研究顯示，老年大鼠骨骼肌線粒體三羧酸循環(huán)限速酶活性均低于年輕大鼠，經(jīng)12周跑臺運(yùn)動后限速酶活性均提高，且顯著高于不運(yùn)動的同齡大鼠和年輕大鼠。說明老化本身不是導(dǎo)致線粒體功能障礙的主要原因，老化可能與久坐的生活方式和較低的能量需求有關(guān)[16]。此外，老年骨骼肌線粒體仍可對運(yùn)動產(chǎn)生適應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的有氧工作能力。其機(jī)制可能為：運(yùn)動提高了老年機(jī)體骨骼肌線粒體抗氧化酶活性, 降低脂質(zhì)過氧化損傷，維護(hù)和增強(qiáng)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能。另一方面，運(yùn)動使線粒體三羧酸循環(huán)功能增強(qiáng)，促進(jìn)呼吸鏈電子傳遞，減少電子漏和自由基生成，從而形成良性循環(huán)。

Tab. 3 Comparison of activities of respiratory chain complex I ～ Ⅳ in rat skeletal muscle mitochondria among the three groups (IU/L, n=10)

RCC: Respiratory chain complex

*P<0.05,**P<0.01vsYC group；##P<0.01vsAC group

3.3 有氧運(yùn)動對衰老大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈功能的影響

研究表明，線粒體呼吸控制率及線粒體編碼的酶活性隨年齡增長而下降[17]。本研究觀察到，隨著年齡的增長，大鼠骨骼肌線粒體RCCⅠ、RCCⅡ、RCCⅣ活性均顯著下降，可能與隨著年齡增長，骨骼肌線粒體自由基損傷增加、mtDNA受損，線粒體編碼的酶合成受到影響及呼吸鏈酶損傷有關(guān)。本研究還顯示，隨著年齡增長，大鼠骨骼肌線粒體RCCⅢ活性顯著提高，這是否是由于RCCⅠ、RCCⅡ活性下降，導(dǎo)致的RCCⅢ活性代償性增加？還需進(jìn)一步研究。

本研究還觀察到，12周有氧運(yùn)動可顯著提高老年大鼠骨骼肌線粒體呼吸鏈酶活性，且顯著高于年輕安靜大鼠，表明老年骨骼肌線粒體呼吸鏈功能仍可對有氧運(yùn)動產(chǎn)生適應(yīng)性提高，從而增強(qiáng)機(jī)體的有氧工作能力。已有研究表明，骨骼肌線粒體具有高度適應(yīng)性，可以根據(jù)組織的代謝需求增加或減少其含量，受到刺激后線粒體生物發(fā)生程序可有效活化，即使年齡較大，有氧運(yùn)動仍可減少骨骼肌線粒體內(nèi)容物的損失、改進(jìn)線粒體功能[16]，這可能與有氧運(yùn)動增加與線粒體生物發(fā)生、融合和裂變有關(guān)的蛋白質(zhì)的含量有關(guān)[18]。另外，線粒體呼吸鏈功能的提高，尤其是RCCⅣ活性提高，可使呼吸鏈電子漏減少，阻止自由基的產(chǎn)生，可有效地保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能。

另有研究認(rèn)為，隨著年齡的增長而發(fā)生的線粒體衰變是不能被抵消的，除非增強(qiáng)身體活動[19]。運(yùn)動刺激可提高老年個體的線粒體適應(yīng)及功能，不僅能改善肌肉功能和生活質(zhì)量[20]，而且可提高健康水平、延長壽命[19]。

綜上所述，有氧運(yùn)動可提高老年大鼠骨骼肌線粒體的抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化水平，提高三羧酸循環(huán)及呼吸鏈功能，促進(jìn)線粒體能量代謝，延緩衰老過程中線粒體功能的退行性變化。