趙丹丹， 郭 展， 李 曦， 張永強， 張 莉， 朱五福， 鄭鵬武△， 楊丹鳳△

(1. 江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330013； 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所， 天津 30050)

近年來，隨著灰霾、霧霾天氣的普遍發(fā)生，空氣污染尤為嚴重。2013年10月，國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)已將室外大氣污染列為人類致癌物之一[1]。大氣顆粒物是空氣環(huán)境中化學(xué)成分最復(fù)雜、人群危害最嚴重的污染物之一。按空氣動力學(xué)直徑，可將顆粒物劃分為：可吸入顆粒物(PM10，空氣動力學(xué)直徑<10 μm)、細顆粒物(PM2.5，空氣動力學(xué)直徑<2.5 μm)和超細顆粒物(ultrafine particles, UFPs，空氣動力學(xué)直徑<0.1 μm)，其中超細顆粒物所占總顆粒數(shù)的比率可達到92%[2]。流行病學(xué)調(diào)查和毒理學(xué)研究顯示，顆粒越小毒性越大，尤其是UFPs。近年來，在輪胎、橡膠產(chǎn)品、非橡膠產(chǎn)品以及顏料和油墨的生產(chǎn)、制作等多個領(lǐng)域納米炭黑顆粒的應(yīng)用逐漸增多，使得人們在研究、生產(chǎn)、消費和環(huán)境中接觸納米炭黑顆粒的機會也迅速增多。研究表明，納米炭黑顆粒能引發(fā)體內(nèi)外系統(tǒng)中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[3,4]。采用經(jīng)鼻吸入或者氣管滴注方式暴露于納米炭黑顆粒均可導(dǎo)致嚙齒動物肺部發(fā)生炎癥反應(yīng)[5]，在小鼠肺部可觀察到劑量依賴性或時間依賴性的炎細胞浸潤，加劇ROS的形成[6]。與此同時，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，低溫刺激和冷空氣活動可使呼吸系統(tǒng)疾病，如上呼吸道感染、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、慢性支氣管炎、肺炎、哮喘等的發(fā)病風(fēng)險明顯增加[7]。鑒于我國近幾年冬季霧霾天氣尤為嚴重，機體面臨超細顆粒物及寒冷暴露的雙重負荷刺激，本研究在Husain等[8]人的研究基礎(chǔ)上，選擇0.45 mg/ml及4.05 mg/ml納米炭黑顆粒懸液作為染毒濃度，4 ℃作為動物實驗冷暴露溫度，擬通過建立納米炭黑顆粒復(fù)合寒冷暴露動物模型，探討二者協(xié)同對機體氧化應(yīng)激水平的影響，為寒冷環(huán)境下納米級炭黑顆粒危害性評價提供毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，納米炭黑顆粒購自北京德科島金科技有限公司，AJY220電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，CNL-24多樣品組織研磨機(天津市科萊恩實驗儀器有限責(zé)任公司)，TGL-6臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，酶標儀(瑞士Tecan公司)。

納米炭黑顆粒染毒液的制備：用生理鹽水緩慢沖洗正常小鼠肺部,采集到的肺泡灌洗液于4 ℃、1 500 r/min離心15 min，取上清配制含10%無細胞肺泡灌洗液的生理鹽水液，用作納米炭黑顆粒的分散液。準確稱取18 mg納米炭黑顆粒，加入4 ml配制好的分散液后密封，置漩渦振蕩混勻器上初步振蕩混勻，再超聲振蕩2 h，配制成4.05 mg/ml的高劑量納米炭黑顆粒染毒液，稀釋9倍制成0.45 mg/ml低劑量染毒液。

1.2 實驗動物分組和染毒方法

72只健康SPF級雄性C57BL/6小鼠，體重(18±2) g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)溫度為(20±2)℃，相對濕度(50±10)%，自然光照，普通飼料喂養(yǎng)。實驗期間小鼠可自由進食飲水。適應(yīng)一周后，將實驗動物隨機分為6組：對照(Ctrl)組、冷暴露(C)組、低劑量染毒(L)組、低劑量染毒復(fù)合冷暴露(LC)組、高劑量染毒(H)組、高劑量染毒復(fù)合冷暴露(HC)組，每組12只。采用吸入式氣管滴注方式進行一次性染毒。Ctrl和C組小鼠各滴注含納米炭黑顆粒分散液40 μl，L和LC組小鼠各滴入濃度為0.45 mg/ml的染毒液40 μl，H和HC組小鼠各滴入濃度為4.05 mg/ml的染毒液40 μl。將所有冷暴露處理組小鼠兩只一籠置于4 ℃進行4 h/d的冷暴露處理，共20 d。冷暴露期間所有小鼠禁食禁水。定期稱取小鼠體重并記錄。

1.3 小鼠肺重量及其臟器指數(shù)的測定

冷暴露結(jié)束24 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠。小鼠稱重后，打開胸腔取出全肺，用冷生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干后稱全肺濕重，以全肺濕重占小鼠體重之比計算小鼠肺臟器指數(shù)。

1.4 小鼠肺氧化應(yīng)激指標的測定

取肺組織，按1：9 (g/ml)比例加入PBS制成10%的組織勻漿，以3 500 r/min離心20 min，取上清分裝于離心管中，置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用相關(guān)試劑盒測定SOD活力、GSH-Px活力和MDA含量。

1.5 小鼠肺組織學(xué)觀察

取3只小鼠肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛液固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色、脫水透明。制片后于光鏡下觀察組織病理改變。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 納米炭黑顆粒表征

在透射電鏡下對納米炭黑顆粒進行表征，結(jié)果見圖1。TEM檢測結(jié)果表明：炭黑顆粒大體呈葡萄球狀，分散性較好，顆粒直徑為30～50 nm。

2.2 小鼠體重變化

在動物建模過程中，各組小鼠行為活動無異常，飼料和水的消耗量無明顯差異。小鼠體重變化情況(表1)表明：單純冷暴露組與納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組的小鼠體重均顯著低于對照組(P<0.05)，單純冷暴露組和納米炭黑顆粒染毒復(fù)合寒冷雙重暴露組小鼠體重均顯著低于單純?nèi)径窘M(P<0.05)，但低劑量染毒復(fù)合冷暴露和高劑量染毒復(fù)合冷暴露組之間無顯著差異；對照組和單純?nèi)径窘M小鼠體重在染毒14 d后顯著升高(P<0.05)，單純冷暴露組與納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組小鼠體重在冷暴露開始后顯著減少(P<0.05)，在染毒14 d后小鼠體重均無顯著變化。兩因素方差分析顯示，冷暴露對小鼠體重變化產(chǎn)生主效應(yīng)，納米炭黑顆粒物染毒與冷暴露復(fù)合對小鼠體重變化無交互作用。

Fig.1Characterization of Nanoscale Carbon Black Particles by TEM

Tab. 1 Effects of Nano-carbon black particles combined with cold exposure on the body weight of n=10)

Ctrl: Control group; C: Cold exposure group; L: Low dose group; LC: Low dose combined with cold exposure group; H: High dose group; HC: High dose combined with cold exposure group

*P<0.05，**P<0.01vsCtrl at the same day；#P<0.05vsthe same group on 0 day；△P<0.05，△△P<0.01vsL group at the same day;▲P<0.05，▲▲P<0.01vsH group at the same day

2.3 小鼠肺臟器指數(shù)的變化

納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組小鼠肺組織重量及肺指數(shù)的變化見表2。與對照組相比，各組肺組織重量及其肺指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。

2.4 肺組織病理學(xué)改變

納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組小鼠肺部組織病理學(xué)改變見圖2。由圖2可見，對照組與單純冷暴露組小鼠肺泡壁均顯示增厚并有輕微充血現(xiàn)象(圖2A、2B)；單純?nèi)径窘M及復(fù)合冷暴露的染毒組，肺支氣管腔和肺泡腔內(nèi)均可見散在的黑色顆粒沉積(圖2C、2D、2E、2F)；高劑量染毒組可見肺泡壁明顯增厚，血管內(nèi)有充血現(xiàn)象，部分區(qū)域發(fā)生實變(圖2E)；高劑量染毒復(fù)合冷暴露組可見肺泡結(jié)構(gòu)破環(huán)，排列比較凌亂，有大量的炎細胞浸潤，血管內(nèi)充血明顯(圖2F)。

GroupMass of lung(g)Index of lung(%)Ctrl0.13±0.020.72±0.07 C0.13±0.010.73±0.08L0.13±0.010.71±0.04LC0.13±0.010.73±0.06H0.13±0.020.67±0.04HC0.13±0.020.70±0.06

Ctrl: Control group; C: Cold exposure group; L: Low dose group; LC: Low dose combined with cold exposure group; H: High dose group; HC: High dose combined with cold exposure group

Fig.2Morphological characteristics of lung by H&E staining(HE×200)

A: Control group; B: Cold exposure group; C: Low dose group; D: Low dose combined with cold exposure group; E: High dose group; F: High dose combined with cold exposure group

2.5 小鼠肺部氧化應(yīng)激指標水平

納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露處理小鼠肺部氧化應(yīng)激指標的變化(表3)表明：單純冷暴露組、單純?nèi)径窘M及染毒復(fù)合冷暴露組的SOD活力均顯著低于對照組(P<0.05)；染毒復(fù)合冷暴露組的T-SOD活力有低于單純?nèi)径窘M的趨勢，差異無顯著性(P>0.05)；單純低劑量染毒和單純高劑量染毒組間差異不顯著(P<0.05)。單純高劑量染毒組及高劑量染毒復(fù)合冷暴露組GSH-Px活力顯著低于對照組(P<0.01)，且高劑量染毒組GSH-Px活力顯著低于低劑量染毒組(P<0.01)；高劑量染毒復(fù)合冷暴露組GSH-Px活力顯著低于低劑量染毒復(fù)合冷暴露組(P<0.05)；單純?nèi)径窘M與復(fù)合冷暴露的染毒組之間均無明顯差異(P<0.05)。高劑量染毒組及染毒復(fù)合冷暴露組的MDA含量顯著高于對照組(P<0.01)；炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組MDA含量顯著高于單純冷暴露組(P<0.05)，有稍高于單純?nèi)径窘M的趨勢，差異無顯著性(P<0.05)；單純?nèi)径窘M之間及染毒復(fù)合冷暴露組之間差異不顯著(P<0.05)。兩因素方差分析顯示，冷暴露后肺組織SOD活力顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；隨著染毒劑量的增加，GSH-Px活力逐漸降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；冷暴露與納米炭黑顆粒物對SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響無交互作用。

GroupSOD(U/mg Pro)GSH-Px(U/mg Pro)MDA(nmol/mg Pro)Ctrl70.53±9.371670.29±278.491.83±0.33C56.98±14.28*1551.48±188.042.26±0.60L57.93±8.05*1561.62±273.932.44±0.69LC51.99±9.26*1499.91±191.582.99±0.99*▲ H56.65±6.15*1273.26±228.64**##2.67±0.46**HC50.57±4.51*1206.39±157.51**△3.28±0.69**▲▲

Ctrl: Control group; C: Cold exposure group; L: Low dose group; LC: Low dose combined with cold exposure group; H: High dose group; HC: High dose combined with cold exposure group

*P<0.05，**P<0.01vsCtrl group;##P<0.01vsL group;△P<0.05vsLC group;▲P<0.05，▲▲P<0.01vsC group

3 討論

近年來，我國發(fā)生灰霾天氣的地區(qū)和次數(shù)呈突發(fā)上升趨勢，給人們的生產(chǎn)、生活和健康帶來巨大的危害，而超細顆粒物(UFPs)是灰霾的主要組成成分之一。超細顆粒物又稱納米顆粒物。UFPs的自然來源主要為生物燃燒，包括可控和不可控的森林火災(zāi)、草原火災(zāi)等；人為污染主要包括化石燃料的燃燒及汽車尾氣的排放等。由于納米顆粒具有小尺寸效應(yīng)和高反應(yīng)性，納米顆?？梢圆唤?jīng)過復(fù)雜的轉(zhuǎn)運過程而直接穿透組織屏障或細胞膜進入細胞內(nèi)部，甚至細胞器中，引起細胞調(diào)亡、DNA損傷、炎癥反應(yīng)等[9,10]，從而增加顆粒物的潛在毒性，與大直徑顆粒相比具有更大的健康危害效應(yīng)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，呼吸系統(tǒng)是納米級炭黑顆粒暴露最直接的作用靶點，當顆粒物進入肺組織后，顆粒物粒徑的大小可以影響其在肺內(nèi)的沉積部位，相對于微米級顆粒，納米級炭黑顆粒毒性更強，更容易引起炎癥反應(yīng)[12]。而且納米顆粒引起的活性氧簇(ROS)的生成量與其對肺部的促炎癥效應(yīng)有直接關(guān)系，過量ROS的產(chǎn)生可直接或間接誘導(dǎo)脂類、蛋白質(zhì)及DNA分子結(jié)構(gòu)和功能改變，導(dǎo)致組織損傷[13]。研究發(fā)現(xiàn)，低溫刺激或冷空氣活動可以改變生物體的氧化與抗氧化間的平衡，通過黃嘌呤氧化酶活性增高、髓過氧化物酶活性降低使機體產(chǎn)生過多的自由基，進而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用增強，誘發(fā)氧化損傷[14]。由此可見，納米顆粒及低溫刺激均會對機體造成不良影響。因此，本研究結(jié)合冬季霧霾天氣尤為嚴重的這一現(xiàn)狀，通過對小鼠進行不同劑量納米炭黑顆粒染毒與寒冷暴露的復(fù)合刺激，探討4 ℃刺激下納米炭黑顆粒染毒所致肺組織的氧化損傷情況。

研究結(jié)果表明，單純冷暴露組和染毒復(fù)合冷暴露組小鼠體重均明顯降低，炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組體重均顯著低于單純的染毒組，說明冷暴露及納米炭黑顆粒物對小鼠的整體能量代謝均產(chǎn)生了不同程度的影響，且冷暴露與納米炭黑顆粒的雙重暴露對小鼠整體能量代謝的影響更加嚴重。

小鼠肺部病理檢測顯示，單純?nèi)径窘M及染毒復(fù)合冷暴露組小鼠肺泡腔內(nèi)有黑色顆粒沉積；隨著染毒物濃度的增加，支氣管腔、肺泡腔內(nèi)可見較多黑色顆粒沉積，肺組織纖毛破壞、肺泡壁結(jié)構(gòu)紊亂、肺間隔增厚等變化更加明顯。在染毒低、高濃度組均可見程度不一的充血、炎細胞浸潤等病理改變，復(fù)合冷暴露后肺泡腔內(nèi)出血更加嚴重。這表明納米炭黑顆粒復(fù)合冷暴露對肺組織的破壞更嚴重。

在生理狀態(tài)下，ROS作為中間體產(chǎn)生，受到各種解毒酶(如SOD、GSH-Px、CAT)及各種抗氧化劑(如維生素E和谷胱甘肽)的影響，這些抗氧化酶和抗氧化劑在機體清除自由基、防止各種病理變化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[15]。研究表明，機體受到氧化損傷時，可導(dǎo)致過氧化產(chǎn)物增多進而使組織內(nèi)SOD含量降低[16]。龍杰等發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激使機體SOD活力顯著下降，MDA含量顯著升高[17]；羅斌等發(fā)現(xiàn)，低溫刺激可引起機體SOD活力顯著下降[18]。本實驗中，單純冷暴露組、單純?nèi)径窘M及納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組小鼠肺部的SOD活性明顯低于對照組；GSH-PX特異催化GSH對過氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[19]，本實驗中，高劑量染毒組及高劑量染毒復(fù)合冷暴露組的GSH-Px活力顯著低于對照組，隨著染毒劑量的增加GSH-Px活力降低。這表明冷刺激及納米炭黑顆粒染毒均破壞了機體氧化與抗氧化之間的平衡，從而受到超氧離子自由基和過氧化氫的攻擊，造成細胞損傷。丙二醛(MDA) 是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量高低可直接反映機體脂質(zhì)過氧化的水平、速率和細胞受自由基攻擊損傷的程度等，間接地反映細胞損傷的程度[20]。本實驗中高劑量染毒組，高、低劑量染毒復(fù)合冷暴露組MDA含量顯著高于對照組，表明高劑量納米顆粒染毒及高劑量納米顆粒染毒復(fù)合冷暴露使機體產(chǎn)生了大量的氧自由基，但未能及時清除，從而發(fā)生了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致機體組織器官受到損害。這與高劑量染毒組、高劑量染毒復(fù)合冷暴露組小鼠SOD和GSH-Px活力顯著降低結(jié)果相呼應(yīng)。

綜上表明，納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露可導(dǎo)致小鼠肺部出現(xiàn)不同程度的氧化應(yīng)激損傷，暴露狀況不同對機體抗氧化防御系統(tǒng)的破壞程度亦不同，但納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露導(dǎo)致小鼠肺毒性的具體作用機制有待進一步深入研究。目前已有大量文獻報道大氣顆粒物對人體健康效應(yīng)的影響，但將納米顆粒物染毒與寒冷暴露結(jié)合起來，探討復(fù)合因素對肺組織氧化損傷的影響尚未見報道。本研究著眼于納米炭黑顆粒染毒與寒冷暴露對機體的共同作用，對兩者之間內(nèi)在聯(lián)系進行的初步分析表明，納米炭黑顆粒復(fù)合寒冷暴露可導(dǎo)致小鼠肺部炎癥反應(yīng)加重，氧化應(yīng)激水平升高，寒冷與納米炭黑顆粒之間無交互作用，這一結(jié)果可為冬季霧霾天氣對健康的危害性提供毒理學(xué)基礎(chǔ)。