王希梅， 郭 玫， 王志旺， 張 程小麗

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)， 蘭州 730000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變化與繼發(fā)性骨質(zhì)增生為基本特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，隨著社會老齡化的加劇，OA已成為常見病、多發(fā)病[1]。近年來研究顯示[2,3]，局部使用植物多糖對OA有明顯的療效，如譚楊等[3]研究發(fā)現(xiàn)人參多糖對骨關(guān)節(jié)炎有明顯的治療作用。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)紅芪多糖對肝纖維化動物的骨丟失有一定的影響[4]，尚未發(fā)現(xiàn)紅芪多糖在骨關(guān)節(jié)炎方面的研究。紅芪所含紅芪總多糖是紅芪的主要有效成分，采用溶劑法從紅芪中分離、純化得紅芪總多糖(hedysari polysaccharides，HPS)，采用Sephadex色譜法從HPS中分離得到紅芪多糖HG-1(hedysari polysaccharide HG-1，HHG-1)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HHG-1是由葡萄糖組成的均多糖；預(yù)實(shí)驗(yàn)提示紅芪總多糖對OA有一定的療效。本實(shí)驗(yàn)在上述研究的基礎(chǔ)上復(fù)制OA模型，觀測關(guān)節(jié)活動性、關(guān)節(jié)滑膜的病理變化及糖胺多糖的含量、血液流變學(xué)及抗組織氧化酶的活性，探討HPS及HHG-1對大鼠OA的治療作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

中藥紅芪采自甘肅省隴西縣首陽鎮(zhèn)，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根； HPS采用水提醇沉法制備，經(jīng)苯酚-硫酸法在490 nm處測定總多糖含量84.66%； HHG-1采用葡聚糖凝膠G-200分離獲得，純度為98.30%。透明質(zhì)酸鈉(sodium hyaluronate，SHA)，山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20067379，批號160916014。木瓜蛋白酶(papain)，Sigma公司產(chǎn)品，批號：BCBR9920V。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

BS1103型電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-16G冷凍高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；722型分光光度儀，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；CH-212型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus產(chǎn)品；BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物

Wistar大鼠，雌雄各半，180～220 g，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號SCXK(甘)2010-0001。甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施使用許可證號SYXK(甘)2011-0001。

1.4 分組、造模及給藥

將56只Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按性別、體重隨機(jī)分為7組(n=8)：即空白對照組(Control)、模型對照組(Model)、陽性對照組(SHA)、紅芪總多糖高劑量組(HPS-H，)、紅芪總多糖低劑量組(HPS-L)、紅芪多糖HG-1高劑量組(HHG-1-H)、紅芪多糖HG-1低劑量組(HHG-1-L)。根據(jù)文獻(xiàn)[5]結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，大鼠每個(gè)膝關(guān)節(jié)腔注射4%的木瓜蛋白酶50 μl。每隔3 d注射1次，連續(xù)注射3次，空白對照組同法注射等體積生理鹽水。造模第10天開始每個(gè)膝關(guān)節(jié)腔注射藥液0.1 ml(HPS 1.05、0.35 mg/joint、HHG-1 0.45、0.15 mg/joint、SHA 1.00 mg/joint)，每隔3 d注射1次，空白對照組注射生理鹽水0.1 ml，連續(xù)5周。

1.5 指標(biāo)測定

末次給藥24 h后用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，在恒定拉力下測定膝關(guān)節(jié)最大屈伸角度(活動度)。股靜脈取血，抗凝，測定血液粘度，剩余血液凝固，分離血清，按試劑盒說明書測定血清SOD活性、GSH-Px、MDA含量。處死大鼠，切取完整的左側(cè)膝關(guān)節(jié)，立即打開關(guān)節(jié)腔，刮取關(guān)節(jié)面上的滑膜組織，測定滑膜厚度，之后置于冰浴中的組織勻漿器內(nèi)，加入冰生理鹽水，制成2%滑膜組織勻漿，在4℃下4 000 r/min離心10 min，取上清液測定糖胺多糖(glycosaminoglycan, GAG)含量(二甲基亞甲藍(lán)分光光度法)。切取右側(cè)股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)，經(jīng)甲醛固定、脫鈣、石蠟包埋、切片后HE染色，在200倍光鏡下觀察關(guān)節(jié)病理學(xué)變化，參考Mankin’s評分標(biāo)準(zhǔn)[6]對軟骨組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HPS及HHG-1對膝關(guān)節(jié)活動范圍及關(guān)節(jié)滑膜厚度的影響

與空白對照組比較，OA模型組膝關(guān)節(jié)伸展角度明顯變小，關(guān)節(jié)面滑膜明顯增厚(P<0.01)；經(jīng)HPS及HHG-1干預(yù)后，與模型對照組比較，膝關(guān)節(jié)伸展角度明顯變大，關(guān)節(jié)面滑膜厚度明顯減小(P<0.05,P<0.01，表1)。

2.2 HPS及HHG-1對關(guān)節(jié)滑膜中糖胺多糖含量的影響

OA模型組關(guān)節(jié)滑膜組織中糖胺多糖的含量顯著下降，與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；HPS組及HHG-1組關(guān)節(jié)滑膜組織中糖胺多糖的含量明顯升高，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01，表2)。

2.3 HPS及HHG-1對關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響

光學(xué)顯微鏡下，空白對照組大鼠膝關(guān)節(jié)表面平整光滑，軟骨分層及潮線清晰可見(圖1A)；OA模型組關(guān)節(jié)表面凹凸不平，多毛刺，局部偶有塌陷，軟骨分層及潮線模糊不清(圖1B)。HPS組及HHG-1組大鼠關(guān)節(jié)病理變化出現(xiàn)不同程度的緩解(圖1D, 圖1E, 圖1F, 圖1G)。對大鼠膝關(guān)節(jié)的病理變化進(jìn)行Mankin’s評分，結(jié)果顯示，局部注射木瓜蛋白酶后大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯病理變化，Mankin’s評分顯著升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)HPS和HHG-1干預(yù)后，Mankin’s評分明顯下降，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01，表2)。

GroupStretching angle (°)Synovial thickness (μm)Control155.0±5.5234.5±36.4Model143.1±6.0**362.1±52.8**SHA153.1±6.8##262.4±42.0##HPS-H151.6±6.5#275.6±44.6#HPS-L150.6±6.3#306.5±51.1#HHG-1-H152.5±6.6##270.4±43.6##HHG-1-L150.9±5.8#296.4±47.0#

SHA: Sodium hyaluronate; HPS-H: High-dose group of hedysari polysaccharides; HPS-L: Low-dose group of hedysari polysaccharides; HHG-1-H: High-dose group of hedysari polysaccharide HG-1; HHG-1-L: Low-dose group of hedysari polysaccharide HG-1

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Fig.1Effects of HPS and HHG-1 on joint histopathology in OA rats (HE ×200)

A: Control group; B: Model group; C: Sodium hyaluronate group; D: High-dose group of hedysari polysaccharides; E: Low-dose group of hedysari polysaccharides; F: High-dose group of hedysari polysaccharide HG-1; G: Low-dose group of hedysari polysaccharide HG-1

GroupGAG (ng/mg)Mankin’s scoreControl624.1±64.40.25±0.46Model425.6±38.3**4.25±1.49**SHA536.9±56.6##2.50±1.20#HPS-H501.6±46.6##2.25±1.04##HPS-L469.0±41.8#△2.63±1.19#HHG-1-H516.0±48.6##2.38±1.06## HHG-1-L474.9±44.9#△3.13±1.46

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vsSHA group

2.4 HPS及HHG-1對血液粘度的影響

采用木瓜蛋白酶復(fù)制OA模型后，與空白對照組比較，大鼠全血低切、中切及高切血粘度顯著升高(P<0.01)。經(jīng)HPS及HHG-1干預(yù)后，與模型對照組比較，全血粘度不同程度下降(P<0.05,P<0.01，表3)。

GroupLow shear(1/10)Medium shear(1/60)High shear(1/150)Control11.21±2.426.54±1.775.11±1.50Model20.80±4.72**12.70±2.65**9.68±2.29**SHA14.37±2.99##8.55±2.61##6.85±2.03#HPS-H14.14±2.91##8.36±2.51##6.83±1.90#HPS-L15.98±3.64#9.98±2.41#7.36±2.20HHG-1-H14.10±2.86##8.30±2.49##6.79±1.80#HHG-1-L15.68±3.13#9.92±2.64#7.08±1.99#

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.5 HPS及HHG-1對血清抗氧化系統(tǒng)的影響

與空白對照組比較，OA模型組血清SOD、GSH-Px活性顯著下降，MDA含量顯著升高，(P<0.01)。在HPS及HHG-1的干預(yù)下，與模型對照組比較，SOD、GSH-Px的活性明顯升高，MDA的含量下降(P<0.05,P<0.01，表4)。

GroupSOD (U/ml)GSH-Px(U/ml)MDA(nmol/ml)Control108.09±10.36307.11±58.407.25±1.39Model87.10±8.83**219.67±46.02**16.91±3.62**SHA105.98±10.46##286.33±53.56#9.34±2.59##HPS-H103.09±10.03##288.22±54.11#9.48±2.61##HPS-L96.11±9.87245.33±48.8912.16±2.96#HHG-1-H106.52±10.94##290.67±56.08#8.98±2.24##HHG-1-L98.12±9.72#276.33±50.23#11.59±2.71##

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3 討論

OA好發(fā)于膝關(guān)節(jié)、脊柱及手指關(guān)節(jié)等部位，是以關(guān)節(jié)軟骨退變和骨質(zhì)增生為基本特征的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)疾病。隨著全球老齡化的加劇，OA的發(fā)病率迅速增加，部分地區(qū)60歲以上人群OA的發(fā)病率甚至高達(dá)50%，嚴(yán)重影響人民的生活質(zhì)量并加重人民的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。OA的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上藥物對OA治療的目的是緩解關(guān)節(jié)疼痛、改善關(guān)節(jié)功能，目前尚無有效的根治措施。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸是目前治療OA廣泛使用的方法之一[7]。透明質(zhì)酸是一種酸性黏多糖，近年來有人[8,9]將植物多糖注入關(guān)節(jié)腔，發(fā)現(xiàn)對OA亦有明顯的療效。紅芪為甘肅道地藥材，HPS為紅芪的主要有效成分，含量達(dá)4%以上，采用葡聚糖凝膠從紅芪總多糖中分離出HHG-1，HHG-1是由葡萄糖構(gòu)成的均一多糖。本研究顯示，HPS及HHG-1局部給藥后能擴(kuò)大OA膝關(guān)節(jié)的伸展角度，改善關(guān)節(jié)局部病理學(xué)變化。另一方面，關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中蛋白多糖合成減少或降解增多導(dǎo)致軟骨的抗壓緩沖功能降低，局部壓力過大而刺激骨質(zhì)增生，因此，軟骨退變與骨質(zhì)增生為OA的基本病理特征。軟骨中蛋白多糖的合成不足是軟骨退變的主要表現(xiàn)之一，而糖胺多糖(GAGs)是蛋白多糖的最主要成分(占蛋白多糖分子量的80%～90%)[10]。本研究顯示，HPS及HHG-1能提高軟骨中GAGs的含量，緩解OA關(guān)節(jié)軟骨退變，抑制關(guān)節(jié)面骨質(zhì)異常增生，改善關(guān)節(jié)功能；高劑量的HPS及HHG-1對OA關(guān)節(jié)面骨質(zhì)增生、軟骨中GAGs的影響與透明質(zhì)酸鈉相當(dāng)。

在OA眾多發(fā)病機(jī)制中，改善血液流變學(xué)、提高軟骨代謝水平、緩解自由基損傷日益受到人們的重視。血液粘度升高可致血流緩慢甚至瘀血，引起骨組織缺血缺氧，代謝水平下降，軟骨組織中蛋白多糖等合成水平下降，從而引起軟骨生理功能下降；另一方面，骨組織缺血缺氧可促進(jìn)自由基生成，自由基氧化、破壞骨組織，骨小梁受損兼之激活破骨細(xì)胞，刺激骨質(zhì)改建，最終引起骨質(zhì)增生[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HPS及HHG-1可降低全血粘度，改善血液流變學(xué)，緩解骨組織代謝障礙，提高抗氧化酶的活性，緩解自由基對軟骨的損傷，改善OA關(guān)節(jié)功能。

綜上所述，HPS及HHG-1對OA有一定的治療作用，高劑量的HPS和HG-1比低劑量有更好的療效趨勢，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)HPS與HG-1的療效明顯差異；改善血液流變學(xué)而改善關(guān)節(jié)軟骨代謝水平、提高抗氧化酶活性而保護(hù)軟骨及滑膜組織是其作用機(jī)制之一。