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        程氏蠲痹湯的抗炎鎮(zhèn)痛作用

        2018-08-29 01:37:40牛小雪陳培柱杜玉芝徐紅梅
        關(guān)鍵詞:致炎程氏抗炎

        牛小雪,陳培柱,杜玉芝,徐紅梅

        (合肥工業(yè)大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院藥學(xué)系,安徽 合肥 230009)

        程氏蠲痹湯是清代新安醫(yī)家程國彭創(chuàng)立的著名方劑,臨床用于治療痹病十分有效[1-3],為歷代醫(yī)家所推崇。風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。程氏蠲痹湯由羌活、獨活、秦艽、當(dāng)歸等10味藥材組成,具有祛風(fēng)除濕、舒筋通絡(luò)、活血行滯等功效[4-5],對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有較好的療效,但有關(guān)其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的實驗研究尚顯不足。本實驗對程氏蠲痹湯的抗炎、鎮(zhèn)痛活性進行評價,為其臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供實驗依據(jù)。

        1 材料

        1.1 試驗藥物 中藥材秦艽(批號 15020703)、羌活(批號 14011505)、獨活(批號 14042504)、川芎(批號 14051601)、當(dāng)歸(批號 14051401)、海風(fēng)藤(批號 15020603)、桑枝(批號 14041803)、木香(批號 14031602)、乳香(批號 13112901)和甘草(批號 13050801)為程氏蠲痹湯原方藥物,均購自合肥樂家老鋪中藥材有限公司。

        藥材中揮發(fā)油成分的提取:取獨活、海風(fēng)藤各100 g,乳香、木香各60 g,投入10 L圓底燒瓶,加入8倍量蒸餾水,熱回流提取2次,收集揮發(fā)油,4 ℃遮光儲藏、備用。

        藥材中醇溶性、水溶性成分的提?。喝—毣?、川芎、當(dāng)歸和秦艽各100 g,甘草30 g,羌活60 g和桑枝150 g,用75%乙醇加熱回流提取2次,每次2 h,過濾、濾液濃縮得浸膏A。藥渣再用水煎煮2次,每次2 h,過濾、濃縮得浸膏B。程氏蠲痹湯藥液:合并上述醇提物(A)、水提物(B)和揮發(fā)油,減壓濃縮,使藥液的生藥含量為1.02 g/mL,4 ℃遮光儲藏,備用。使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液稀釋至1.02、0.51、0.255 g/mL。

        雷公藤多苷片(glucosides ofTripterygiumwifordii,GTW;批號 141202):上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司;阿司匹林腸溶片(批號 100901):廣東九名制藥有限公司。實驗前均用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度。

        1.2 試劑 二甲苯:國藥集團;角叉菜膠(批號 CAS 11114-20-8):Adamas公司;弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA;批號 CAS 9007-81-2):Sigma公司。

        1.3 儀器 JA 2004 N 型電子天平:上海精密科學(xué)儀器公司;YLS-7B足趾容積測量儀:淮北振華公司;RB-200熱板儀:上海益聯(lián)科教設(shè)備有限公司;打孔器。

        1.4 動物 雌性昆明種小鼠[100只,體質(zhì)量(20±2)g]、雄性昆明種大鼠[96只,體質(zhì)量(180±20)g]:均由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2017-001]提供。

        2 方法

        2.1 程氏蠲痹湯對熱板致痛小鼠痛閾的影響 取雌性昆明種小鼠,放在(55.0±0.5)℃的金屬熱板上,測定每只小鼠的痛閾值(即疼痛反應(yīng)潛伏期,指小鼠接觸熱板至舔后足的時間),痛閾在5~30 s內(nèi)為痛閾正常小鼠。取痛閾正常小鼠50只,隨機分為空白組,阿司匹林組(0.05 g/kg),程氏蠲痹湯高劑量(20.40 g/kg,相當(dāng)于60 kg成人臨床用藥量的24倍)、中劑量(10.20 g/kg)、低劑量(5.10 g/kg)組。各組小鼠灌胃給藥,每日1次,連續(xù)7 d,空白組小鼠給予等容積溶媒。末次給藥1 h后,以小鼠出現(xiàn)舔后足行為作為疼痛反應(yīng)指標(biāo),記錄自投入熱板至出現(xiàn)舔后足的潛伏期,連續(xù)測量3次,取平均值為痛閾。鎮(zhèn)痛效應(yīng)的計算公式:痛閾提高百分率=[(給藥后痛閾-給藥前痛閾)/給藥前痛閾]×100%。

        2.2 程氏蠲痹湯對小鼠急性炎癥耳腫脹度的影響 取雌性昆明種小鼠50只,分組與給藥同“2.1”項。末次給藥1 h后,將0.025 mL二甲苯均勻涂抹于小鼠左耳正反兩面,以右耳為對照,復(fù)制小鼠急性炎癥模型。致炎30 min后,將小鼠頸椎脫臼處死,用直徑9 mm的打孔器,在左右耳廓相同部位打孔取樣,及時稱量耳片質(zhì)量,計算耳腫脹度(左右耳片質(zhì)量差值)及耳腫脹抑制率。耳腫脹抑制率=[(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度] ×100%。

        2.3 程氏蠲痹湯對大鼠急性炎癥足腫脹率的影響 取雄性SD大鼠48只,隨機分為6組,分別為正常組、模型組、GTW組(0.01 g/kg)和程氏蠲痹湯高劑量(10.20 g/kg)、中劑量(5.10 g/kg)、低劑量(2.55 g/kg)組。各組大鼠灌胃給藥,正常組和模型組均灌胃等容量空白溶劑,每日1次,連續(xù)14 d。末次給藥后1 h,于大鼠左后足踝關(guān)節(jié)處作標(biāo)記,測量大鼠足體積。除正常組外,在其他組大鼠左后足跖皮內(nèi)注射0.1 mL角叉菜膠溶液復(fù)制炎癥模型,并于致炎后1、2、4、6 h分別測定大鼠左后足體積。足腫脹率=[(Vt-Vn)/Vn]×100%,Vn、Vt分別代表大鼠致炎前、致炎后足體積。

        2.4 程氏蠲痹湯對大鼠慢性炎癥足腫脹率和屈關(guān)節(jié)疼痛評分的影響 動物分組及給藥同“2.3”項。除正常組外,其余各組大鼠均于左后足跖皮內(nèi)注射0.1 mL CFA復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)模型。致炎后第15天灌胃給藥,每日1次,連續(xù)14 d。

        2.4.1 足腫脹度的檢測 在致炎前及致炎后第14、17、20、22、25、28天分別測量各組大鼠的左后足體積及繼發(fā)側(cè)足體積,并計算各組大鼠足腫脹率,計算方法同“2.3”項。

        2.4.2 屈關(guān)節(jié)疼痛評分(縮腿嘶鳴評分) 在致炎第0、5、14、20、26天,進行背屈和趾屈關(guān)節(jié)疼痛實驗評分。具體如下:用固定器將大鼠頭部固定,使其兩后腿和尾部伸出,穩(wěn)定后進行測定。①趾屈:將大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)向腳掌側(cè)緩慢且柔和彎曲,每間隔5 s進行一次,共5次。若大鼠出現(xiàn)短促而明顯的縮腿或嘶叫反應(yīng)則評分為1,無反應(yīng)評分為0。分別記錄其縮腿和嘶叫評分,每種指標(biāo)的評分為0~5分,兩種指標(biāo)的評分相加,每只大鼠的總評分為0~10分。②背屈:將大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)向腳背側(cè)緩慢且柔和彎曲,評分方法同趾屈關(guān)節(jié)評分。用縮腿和嘶叫二者的總評分來反映大鼠關(guān)節(jié)疼痛的程度。

        3 結(jié)果

        3.1 程氏蠲痹湯對小鼠痛閾的影響 與空白組比較,給藥組小鼠更耐痛,痛閾提高百分率顯著上升(P<0.05);其中程氏蠲痹湯高、中劑量組痛閾提高百分率與阿司匹林組相近,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

        表1 程氏蠲痹湯對小鼠痛閾的影響

        注:與空白組比較,*P<0.05;與阿司匹林組比較,#P<0.05

        3.2 程氏蠲痹湯對小鼠耳腫脹度的影響 與空白組比較,二甲苯致炎后,阿司匹林組和程氏蠲痹湯高、中劑量組小鼠耳腫脹度顯著降低(P<0.05);程氏蠲痹湯低劑量組對小鼠耳腫脹的抑制率顯著低于阿司匹林組(P<0.05),而其高、中劑量組藥效與阿司匹林組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

        3.3 程氏蠲痹湯對大鼠急性炎癥足腫脹率的影響 角叉菜膠致炎1 h后,即可引起模型組大鼠足部顯著腫脹(P<0.05);在致炎后各時間段,GTW組和程氏蠲痹湯高、中劑量組大鼠的足腫脹率均顯著低于模型組(P<0.05),且致炎后4 h效果最為顯著;程氏蠲痹湯低劑量組大鼠足腫脹率在致炎后2~6 h與GTW組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而其高、中劑量組與GTW組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

        表2 程氏蠲痹湯對小鼠耳廓腫脹度的影響

        注:與空白組比較,*P<0.05;與阿司匹林組比較,#P<0.05

        表3 程氏蠲痹湯對大鼠急性炎癥足腫脹率的影響

        注:與正常組比較,△P<0.05;與模型組比較,*P<0.05;與GTW組比較,#P<0.05;與致炎1 h后比較,aP<0.05;與致炎2 h后比較,bP<0.05;與致炎4 h后比較,cP<0.05

        3.3 程氏蠲痹湯對AA大鼠疼痛與足腫脹率的影響 AA大鼠在致炎后第14 d,其原發(fā)側(cè)和繼發(fā)側(cè)足腫脹率、屈關(guān)節(jié)疼痛評分明顯高于正常組(P<0.05);與模型組比較,致炎后第20天,GTW組和程氏蠲痹湯高、中劑量組大鼠原發(fā)側(cè)及繼發(fā)側(cè)足腫脹率和屈關(guān)節(jié)疼痛評分明顯降低(P<0.05);且程氏蠲痹湯高、中劑量組大鼠足腫脹率和屈關(guān)節(jié)疼痛評分與GTW組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4、表5。

        表4 程氏蠲痹湯對AA大鼠原發(fā)側(cè)和繼發(fā)側(cè)足腫脹率的影響

        注:與正常組比較,△P<0.05;與模型組比較,*P<0.05;與GTW組比較,#P<0.05

        4 討論

        炎癥是機體對損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng),根據(jù)持續(xù)時間不同分為急性和慢性。急性炎癥以發(fā)紅、腫脹、疼痛等為主要癥狀,而慢性炎癥可由急性炎癥遷延而來,病程較長,且臨床表現(xiàn)多樣,診斷及治療相對困難。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病,其基本病理是由免疫失控所引發(fā)的慢性滑膜炎癥,主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛、僵直,屈伸不利[6-7]。持續(xù)的慢性炎癥可引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的損害,導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)畸形,給患者帶來極大的痛苦。目前臨床上對RA的治療主要是緩解急性發(fā)作癥狀(如關(guān)節(jié)疼痛和腫脹),抑制炎性因子的釋放以及提高機體免疫抑制功能等。中醫(yī)藥因其治療RA療效確切,毒性和不良反應(yīng)較小而引起醫(yī)學(xué)界的極大關(guān)注。

        表5 程氏蠲痹湯對AA大鼠縮腿嘶鳴評分的影響

        注:與正常組比較,△P<0.05;與模型組比較,*P<0.05;與GTW組比較,#P<0.05

        現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,程氏蠲痹湯方中秦艽具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用,可調(diào)節(jié)機體炎性因子如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-4的表達(dá)[8-9]。海風(fēng)藤提取物可以通過降低大鼠滑膜組織中腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6、核因子-κB、核因子-κB抑制因子和核因子-κB激酶抑制因子及其mRNA的表達(dá),發(fā)揮其抗炎、抗風(fēng)濕作用[10]。桑枝、木香可通經(jīng)活絡(luò),佐以當(dāng)歸、川芎、乳香可理氣養(yǎng)血、活血行滯。許霞等[11]研究發(fā)現(xiàn),程氏蠲痹湯加減方含藥血清可以下調(diào)AA大鼠外周血單核細(xì)胞腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β的水平。但程氏蠲痹湯的抗炎鎮(zhèn)痛作用及其對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療效果卻鮮見報道。本實驗通過熱板法和二甲苯致炎法[12-13]考察程氏蠲痹湯對小鼠的抗炎鎮(zhèn)痛效果;利用角叉菜膠[14]和弗氏完全佐劑復(fù)制大鼠炎癥模型,分別評價程氏蠲痹湯對大鼠急性和慢性炎癥的療效。結(jié)果顯示,20.40、10.20 g/kg程氏蠲痹湯可顯著提高小鼠的痛閾,抑制急性耳腫脹,10.20、5.10 g/kg程氏蠲痹湯可顯著緩解大鼠炎性足腫脹,并減輕AA大鼠屈關(guān)節(jié)疼痛。結(jié)果表明,程氏蠲痹湯對小鼠、大鼠的急性和慢性炎癥均具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛效果。本研究結(jié)果可為程氏蠲痹湯治療RA提供實驗依據(jù),但其抗炎鎮(zhèn)痛的機制尚待進一步研究。

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