劉海濤，邵 杰，王 剛，梁益敏，楊 陵，王國(guó)凱

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012； 2.安徽邦寧制藥有限公司，安徽 寧國(guó) 242300)

植物內(nèi)生菌是指其生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期生活在健康植物組織內(nèi)部，并不引起宿主植物出現(xiàn)明顯病害癥狀的微生物，包括內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌[1]。內(nèi)生真菌廣泛存在于植物各個(gè)器官、組織的細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間隙之中，由于它們和其寄主植物長(zhǎng)期共生，內(nèi)生真菌除了產(chǎn)生一些獨(dú)特的代謝產(chǎn)物外，還往往可以產(chǎn)生與寄主植物代謝產(chǎn)物相近甚至相同的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，研究表明這些活性成分具有顯著的抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用[2-4]。

中藥前胡為傘形科植物白花前胡(P.praeruptorumDunn.)的干燥根，始載于《名醫(yī)別錄》，具有宣散風(fēng)熱、降氣祛痰的功效，可用于風(fēng)熱感冒、咳嗽痰多、痰熱喘滿等癥[5]。安徽省寧國(guó)市地處皖南山區(qū)天目山北麓，素以盛產(chǎn)道地藥材白花前胡而著稱。該地所產(chǎn)前胡以個(gè)大、皮黑、肉白、條長(zhǎng)、柔軟、香味濃等特點(diǎn)著稱，商品市場(chǎng)俗稱“寧前胡”[6]。目前國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)白花前胡化學(xué)成分和藥理活性等進(jìn)行了廣泛的研究[7-9]，但尚未見有關(guān)于寧前胡內(nèi)生真菌的研究報(bào)道。本研究首次從寧前胡中分離鑒定出多種內(nèi)生真菌，豐富了寧前胡內(nèi)生真菌的種質(zhì)資源，并為進(jìn)一步尋找內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 寧前胡藥材于2017年6月采自安徽省寧國(guó)市港口鎮(zhèn)株木店村，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)梁益敏副教授鑒定為傘形科前胡屬白花前胡(P.praeruptorumDunn.)。培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)，購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器 SPT-P250C智能生化培養(yǎng)箱：合肥華德利科學(xué)器材有限公司；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SW-CJ-2FD雙人單面潔凈工作臺(tái)：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；T-Gradient Thermoblock PCR儀：德國(guó)Biometra公司；G-BOX凝膠成像系統(tǒng)Gene-Snap：英國(guó)Syngene公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；通用引物：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1(5′-TC-CGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TC-CTCCGCTTATTGATATGC-3′)均由上海生工生物工程股份有限公司定制。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌的培養(yǎng)分離與純化 采用組織塊法分離內(nèi)生真菌。保存完好的寧前胡根部，去除須根和葉子，用蒸餾水把根部沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分，晾干。按照常規(guī)表面無菌操作法：依次用75%乙醇漂洗1～2 min，3%次氯酸鈉漂洗3～5 min，75%乙醇漂洗30 s，無菌水沖洗5次。設(shè)置空白對(duì)照，用移液槍移取最后一次沖洗的無菌水200 μL，用涂布棒均勻涂布于PDA培養(yǎng)基的表面，倒置于恒溫28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d，平行3份以驗(yàn)證滅菌效果是否徹底。然后用無菌濾紙充分吸干寧前胡表面水分，再用無菌手術(shù)刀將材料切成0.2 cm×0.2 cm長(zhǎng)段(片)，將上述組織塊分別接種于PDA培養(yǎng)基中，每皿4塊，置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～15 d。觀察組織塊斷面處向PDA培養(yǎng)基周圍長(zhǎng)出形態(tài)特征、顏色差異的菌落時(shí)，用無菌接種環(huán)挑取形態(tài)各異的菌絲或孢子接種于新的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～4代，待純化后轉(zhuǎn)移到PDA斜面試管中編號(hào)備用。

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)初步鑒定 將保存完好的菌株復(fù)壯到PDA培養(yǎng)基平板上，恒溫28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～10 d。內(nèi)生真菌主要的形態(tài)特征包括所分得的菌落大小、表面特征、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)類型以及孢子的形態(tài)，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[10]進(jìn)行初步鑒定分類。

2.3 菌株的分子鑒定

2.3.1 內(nèi)生真菌DNA提取 將純化的內(nèi)生真菌用無菌藥匙刮取表面，放入無菌研缽中，加入2～3次液氮冷凍菌絲體，然后用研杵充分研磨冷凍的菌絲體，應(yīng)隨時(shí)補(bǔ)充液氮以保持低溫，參照試劑盒步驟進(jìn)行操作，得到DNA溶液，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增真菌rDNA-ITS的上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物 ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)體系50 μL，見表1。

表1 PCR擴(kuò)增rDNA-ITS的反應(yīng)體系

2.3.3 PCR擴(kuò)增程序和內(nèi)生真菌rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR擴(kuò)增程序：參照文獻(xiàn)[11]中的方法，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，后將擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，由凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照。檢測(cè)后置于-20 ℃冰箱中保存，備用。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫，與相關(guān)種屬序列進(jìn)行同源性比較，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(national center of biotechnology information，NCBI)數(shù)據(jù)庫BLAST對(duì)序列進(jìn)行相似性分析，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，從而得到真菌的分類地位，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.4 分析方法 定植率(colonization rate，CR)=受內(nèi)生真菌侵染的組織塊數(shù)/全部供試樣本組織塊數(shù)×100%。內(nèi)生真菌的CR可以反映宿主植物受內(nèi)生真菌侵染的程度[12]。分離頻率(separation frequency，SF)=分到內(nèi)生真菌各屬的分離數(shù)/分到內(nèi)生真菌分離總數(shù)×100%。SF>10%的屬定義為某樣區(qū)的優(yōu)勢(shì)屬，5%≤SF≤10%定義為常見屬，SF<5%定義為稀有屬。相對(duì)分離頻率(relative separation frequency，RSF)=分離的某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)/分離的總菌株數(shù)×100%。RSF可以用來計(jì)算植物組織中某種真菌的優(yōu)勢(shì)度[13]。

3 結(jié)果

3.1 寧前胡內(nèi)生真菌的分離 兩個(gè)批次共120個(gè)組織塊來源于6株白花前胡植株樣本，有96個(gè)組織塊不同程度上侵染有內(nèi)生真菌，CR為80%。通過組織塊法從寧前胡中共計(jì)分離得到41株內(nèi)生真菌，分屬于10屬21種。Fusarium12株，Penicillium8株，Aspergillus4株，Alternaria8株，Tricladium1株，Phoma1株，Collariella1株，Rhizoctonia2株，Colletotrichum1株，Trichoderma3株。

3.2 形態(tài)學(xué)鑒定 內(nèi)生真菌通過菌落特征比對(duì)和顯微觀察，LH03、LH06、LH10、LHT16、LHT19表面菌絲相對(duì)密集，棉絮狀，有大量分生孢子，分生孢子梗集結(jié)成分生孢子座，細(xì)長(zhǎng)，分枝，大孢子彎曲呈不明顯的鐮刀形，小型孢子為長(zhǎng)卵圓形。LH02、LH04、LH07、LHT15菌落生長(zhǎng)初期為白色，逐漸變?yōu)榫G色或墨綠色，粉狀，孢子梗直立，頂端一至多次分枝，形成掃帚狀，分枝頂端生瓶狀小梗，頂端生成串的分生孢子。LHT17、LHT20、LHT21菌絲密集，由白色漸變?yōu)槟G色，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，菌絲有隔膜，分生孢子倒棍棒形，橢圓形或卵圓形，頂端有噱狀細(xì)胞和磚隔狀的分生孢子。LH09、LH11菌落表面初期為白色，逐漸變?yōu)樯詈稚?，生成眾多的小顆粒狀孢子團(tuán)，產(chǎn)大量黑色或褐色孢子粉，分生孢子串生、無色，有球形或卵圓形的。LH01、LHT14菌落初為白色，生長(zhǎng)迅速，菌絲多為基內(nèi)生菌絲，漸變?yōu)榫G色，具有透明的瓶梗，分生孢子一般光滑，典型形狀為橢圓形至近似長(zhǎng)方形，很少為球形，大多數(shù)為綠色或者透明。根據(jù)魏景超[10]編著的《真菌鑒定手冊(cè)》，將LH03、LH06、LH10、LHT16、LHT19初步鑒定為鐮孢霉屬(Fusarium)；LH02、LH04、LH07、LHT15初步鑒定為青霉屬(Penicillium)；LHT17、LHT20、LHT21初步鑒定為鏈格孢屬(Alternaria)；LH09、LH11初步鑒定為曲霉屬(Aspergillus)；LH01、LHT14初步鑒定為木霉屬(Trichoderma)；菌株LHT12因不產(chǎn)孢子，形態(tài)和顯微鑒定沒有意義，故通過分子生物學(xué)鑒定。初步鑒定為鐮孢霉屬、青霉屬、鏈格孢屬、曲霉屬和木霉屬，5個(gè)屬的形態(tài)與顯微形態(tài)特征見圖1。

3.3 分子生物學(xué)鑒定

3.3.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 對(duì)分離得到的21種內(nèi)生真菌進(jìn)行DNA提取，得到DNA提取液，進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增，550 bp左右處出現(xiàn)一條單一明亮的條帶，見圖2。

圖1 內(nèi)生真菌菌落及顯微結(jié)構(gòu)

注：M.marker；1. LH1；2. LH2；3. LH3；4. LH4；5. LH5；6. LH6；7. LH7；8. LH8；9. LH9；10. LH10；11. LH11；12. LHT12；13. LHT13；14. LHT14；15. LHT15；16. LHT16；17. LHT17；18. LHT18；19. LHT19；20. LHT20；21. LHT21

圖2內(nèi)生真菌16 S rDNA的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

3.3.2 rDNA-ITS序列比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 登陸NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)，將測(cè)序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果見表2。

表2 分離純化得到白花前胡內(nèi)生真菌及鑒定結(jié)果

利用MEGA 4.0和Clustal X軟件對(duì)表2中21種rDNA-ITS分子序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

由表2和圖3可知，寧前胡內(nèi)生真菌分布于10個(gè)屬中，其種類資源非常廣泛。主要分布于Fusarium、Penicillium和Alternaria屬中，占其總數(shù)的68.29%。分布最廣的為Fusarium，共有12株，其RSF為29.27%。而Fusarium中的F.tricinctum和F.verticillioides為其優(yōu)勢(shì)種，其RSF分別為9.76%和7.32%。菌株LHT12通過分子生物學(xué)鑒定為Rhizoctoniabataticola，共有2株，其RSF為4.88%。

圖3 寧前胡內(nèi)生真菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

藥用植物內(nèi)生真菌長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境，其在演化過程中兩者形成了互惠共生關(guān)系，已有研究結(jié)果顯示，內(nèi)生真菌的多樣性受生境的影響顯著，不同產(chǎn)地的同一種藥用植物中內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)存在較大的區(qū)別[14]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)傘形科植物內(nèi)生真菌研究較少，本研究對(duì)安徽道地藥材寧前胡內(nèi)生真菌進(jìn)行培養(yǎng)分離與鑒定，結(jié)果顯示分布最廣的類群是鐮孢霉屬Fusariumsp.，SF為29.27%，為其優(yōu)勢(shì)種屬。鐮孢霉屬廣泛存在于自然界中，在霍山石斛[15]、亳芍[16]、海南粗榧[17]等植物中廣泛存在，能產(chǎn)生重要的活性成分。本研究共分離鑒定5種鐮孢霉屬真菌，分別為unculturedFusarium、F.oxysporum、F.tricinctum、F.verticillioides和F.proliferatum。本研究后期將對(duì)寧前胡內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)種屬的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，以期從中尋找到具有生物活性的先導(dǎo)化合物。