張 鵬，何春玲，郭雨晨，李 瑋，董昌虎

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

再生障礙性貧血(以下簡稱“再障”)為一類骨髓造血能力低下、全血細(xì)胞減少，以貧血、出血、感染為主要臨床表現(xiàn)的骨髓造血功能衰竭的綜合疾病[1]。既往認(rèn)為其發(fā)病機制為造血干細(xì)胞的缺陷、自身免疫功能紊亂、造血微環(huán)境異常3個因素。隨著對其研究的深入，以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫異常被傾向于認(rèn)為是再障的主要發(fā)病機制[2]。但不管是哪一種發(fā)病機制，其最終的結(jié)果是骨髓內(nèi)造血干細(xì)胞減少，造血功能發(fā)生衰竭。現(xiàn)階段針對再障的各種治療方法，最終目的是為了改善骨髓的造血功能，提高生活質(zhì)量。西醫(yī)以免疫抑制劑與雄激素為主治療再障。實踐證明，中醫(yī)藥單用或聯(lián)合西藥能夠提高再障的臨床療效并且降低毒性和不良反應(yīng)。本研究利用二甲磺酸丁酯聯(lián)合環(huán)磷酰胺復(fù)制再障小鼠模型，觀察左歸補髓生血方對再障模型小鼠的治療作用以及對骨髓中造血細(xì)胞凋亡的影響，旨在探究左歸補髓生血方對再障者骨髓中造血干細(xì)胞的改善作用。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級ICR雄性小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，平均體質(zhì)量18.5 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心[生產(chǎn)許可證編號：SCXK(陜)2012-003]提供。

1.2 主要試劑與藥品 左歸補髓生血方(黃牛骨髓 14 g，紫河車、熟地黃、山藥、枸杞子、山茱萸、川牛膝、鹿角膠、龜板膠、菟絲子各7 g)藥材由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供，經(jīng)水煎、濃縮、過濾，配制成約100 mL藥液，濃度約為1.54 g/mL，裝入干凈的100 mL塑料瓶后，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，使用前充分搖勻并煮沸。司坦唑醇(廣西壯族自治區(qū)南寧百會藥業(yè)公司，每片2 mg，每盒24片，國藥準(zhǔn)字號為H45020728，批號為1510027)：使用滅菌用水配制成0.12 mg/mL的懸混液；TUNEL試劑盒：上海Roche制藥公司；蛋白酶K工作液、DAB工作液、蘇木素-伊紅染色試劑盒：武漢賽維爾生物公司；二甲磺酸丁酯、環(huán)磷酰胺：上海索萊寶生物公司；二甲苯、梯度乙醇、中性樹膠、磷酸鹽緩沖液：天津天力化學(xué)試劑廠。

2 方法

2.1 模型復(fù)制、分組以及給藥 參考文獻[3-5]方法并加以改進，小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，隨機選取10只設(shè)為正常組，其余30只小鼠用于復(fù)制再障模型，于第1、3、5、7、9、11天腹腔注射二甲磺酸丁酯10 mg/kg，第2、4、6、8、10、12天注射環(huán)磷酰胺20 mg/kg，模型復(fù)制時間為12 d。將復(fù)制成功的再障模型小鼠隨機分成模型組、中藥組與西藥組，各組12只小鼠，正常組與模型組給予等容量生理鹽水灌胃，中藥組以左歸補髓生血方藥液灌胃，根據(jù)成人等效劑量[6]換算為15.4 g/kg，西藥組給予司坦唑醇懸混液(給藥劑量為2.4 mg/kg)灌胃，中藥組與西藥組灌胃容積均為20 mL/kg，共灌胃15 d。

2.2 標(biāo)本采集 實驗第28天，各組小鼠腹腔注射10%水合氯醛(10 mL/kg)進行麻醉，麻醉后右眼摘取眼球，取血約1 mL，滴入經(jīng)肝素處理過的EP管后，置于全自動動物血細(xì)胞分析儀中檢測血常規(guī)；頸部脫臼處死小鼠，取其右側(cè)股骨，置10%甲醛中固定24 h，放入10% EDTA脫鈣液中脫鈣21 d，脫水，透明，石蠟包埋，制備4 μm切片。按照試劑盒說明書，分別采用蘇木精-伊紅染色法和TUNEL法檢測股骨內(nèi)有核細(xì)胞凋亡。

置于光學(xué)顯微鏡下分別觀察骨髓組織病理切片以及凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者或胞漿或胞膜棕黃色為凋亡陽性細(xì)胞。在400倍顯微鏡下，觀察凋亡細(xì)胞的分布，每組隨機選10個陽性視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，計算平均凋亡細(xì)胞數(shù)所占百分比作為凋亡指數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠外觀行為觀察 正常組小鼠的精神、行動以及反應(yīng)良好，皮毛有光澤，口及四肢末端紅潤，飲食正常；模型組小鼠精神萎靡，活動減少伴扎堆，唇瓣灰白，毛色暗亂，飲食減少；中藥組與西藥組小鼠精神明顯好轉(zhuǎn)，飲食有所增加，皮毛較光澤。

3.2 各組小鼠外周血白細(xì)胞(white blood cell, WBC)、紅細(xì)胞(red blood cell, RBC)、血小板(platelet, PLT)計數(shù)和血紅蛋白(hemoglobin, Hb)濃度比較 與正常組比較，模型組小鼠外周血WBC、RBC、PLT計數(shù)和Hb濃度明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和西藥組外周血WBC、RBC、PLT計數(shù)和Hb濃度明顯升高(P<0.05)；中藥組和西藥組WBC、RBC、PLT計數(shù)和Hb濃度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠外周血WBC、RBC、PLT計數(shù)和Hb濃度比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3.3 各組小鼠骨髓組織形態(tài)學(xué)變化比較 正常組小鼠骨髓細(xì)胞增生活躍，可見紅系、粒系和巨核系細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)均無明顯異常，可見巨核細(xì)胞和成簇血小板以及少量非造血性細(xì)胞，成熟紅細(xì)胞大小均勻，染色正常。與正常組比較，模型組小鼠骨髓增生極度減少，紅系、粒系、巨核細(xì)胞系均明顯減少，造血組織明顯減少，非造血細(xì)胞團易見，可見到大量的脂肪空泡，并伴有明顯的充血現(xiàn)象。與模型組比較，中藥組以及西藥組小鼠骨髓增生程度好轉(zhuǎn)，紅系、粒系、巨核細(xì)胞系均有明顯增生，可見少量非造血組織及脂肪細(xì)胞，造血組織結(jié)構(gòu)明顯修復(fù)，空泡顯著減少。見圖1。

3.4 各組小鼠骨髓腔內(nèi)有核細(xì)胞凋亡率比較 與正常組比較，模型組小鼠骨髓內(nèi)大量空泡伴充血，有核細(xì)胞數(shù)顯著減少，TUNEL染色多為陽性，凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和西藥組小鼠骨髓有核細(xì)胞顯著增加，骨髓腔內(nèi)充血及空泡減少，有核細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中藥組與西藥組骨髓有核細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖2。

注：A.正常組；B.模型組；C.西藥組；D.中藥組

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

注：A.正常組；B.模型組；C.西藥組；D.中藥組；紅色箭頭示凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞明顯固縮，核致密深染為棕黃色或棕褐色，呈均勻的顆粒狀

圖2各組小鼠骨髓中有核細(xì)胞凋亡情況(TUNEL法，DAB顯色后蘇木素染色，10×40倍)

4 討論

隨著再障發(fā)病率的逐年升高，對其具體發(fā)病機制的研究逐漸深入，取得了一系列階段性的成果，對于臨床診療具有極大的指導(dǎo)意義?；谠僬显谂R床上主要表現(xiàn)為一系或多系的血細(xì)胞減少，并伴有貧血、感染以及出血等的現(xiàn)實，當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)雖然再障的主要發(fā)病機制是T淋巴細(xì)胞的過度活化導(dǎo)致的免疫紊亂，但主要環(huán)節(jié)是造血干祖細(xì)胞在質(zhì)或量上的異常。在對再障發(fā)病機制的研究方面，無論是“種子”“土壤”學(xué)說亦或是“蟲子”學(xué)說，都認(rèn)為是造血細(xì)胞的凋亡、壞死，引發(fā)骨髓中造血細(xì)胞的缺失，最終導(dǎo)致骨髓衰竭[7]。針對上述研究，本實驗通過復(fù)制再障小鼠模型，使用左歸補髓生血方進行干預(yù)，旨在探究左歸補髓生血方對再障者骨髓中造血干細(xì)胞的改善作用。本次實驗利用二甲磺酸丁酯聯(lián)合環(huán)磷酰胺成功復(fù)制再障模型小鼠，與正常組比較，外周血WBC、RBC、PLT等指標(biāo)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；骨髓增生程度減低，造血細(xì)胞(紅系、粒系、巨核系)及造血組織均減少，非造血組織增多。司坦唑醇為蛋白同化類固醇類雄激素藥，是臨床治療再障的常用藥物，雄激素經(jīng)吸收后在體內(nèi)被還原成5α-雙氫睪酮和5β-雙氫睪酮，通過刺激腎臟產(chǎn)生紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)，使靜止期造血干細(xì)胞向?qū)PO有反應(yīng)階段分化，并外源性補充EPO，增強造血細(xì)胞對EPO的反應(yīng)性，促進骨髓造血[8]。本實驗中加入司坦唑醇作為對照組，治療后小鼠一般狀況改善明顯，外周血中WBC、RBC、PLT計數(shù)和Hb濃度上升，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，骨髓腔內(nèi)造血組織增多，增生程度好轉(zhuǎn)，提示司坦唑醇能有效地治療再障。

細(xì)胞凋亡又稱“細(xì)胞程序性死亡”，正常組織通過細(xì)胞凋亡途徑可以清除體內(nèi)某些異常細(xì)胞，最終保持機體內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡[9]。再障患者CD34+T細(xì)胞表面Fas抗原表達(dá)水平明顯增加[10]，推測再障患者可能存在造血細(xì)胞的過度凋亡。Fas(CD95+T細(xì)胞抗原)是一種膜蛋白，表達(dá)于細(xì)胞表面，當(dāng)與配體結(jié)合后，可以傳遞凋亡信號，引發(fā)骨髓CD34+T細(xì)胞發(fā)生大量凋亡，最后使造血功能衰竭[11]。因此，降低再障患者骨髓內(nèi)造血細(xì)胞凋亡是治療再障的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果表明，左歸補髓生血方明顯降低再障小鼠骨髓腔內(nèi)有核細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，其作用與司坦唑醇相當(dāng)(P>0.05)，提示左歸補髓生血方能夠通過降低再障小鼠骨髓內(nèi)造血細(xì)胞凋亡而改善造血功能，緩解病情進展。

根據(jù)再障所引起的貧血、出血、感染等典型癥狀，可將其歸屬為中醫(yī)學(xué)“虛勞”“髓勞”“血勞”等范疇?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》提出“腎生骨髓”，腎為先天之本，受五臟六腑之精氣而藏之，主骨生髓，腎精充則化血，腎精虧則骨髓造血功能不足，導(dǎo)致生血障礙。閆昱江等因此提出“補腎為本、健脾益氣”治療再障的觀點[12]。左歸補髓生血方是在補腎名方左歸丸的基礎(chǔ)上，加入紫河車與牛骨髓而制成的自擬藥方。方中熟地黃滋腎填精，山藥、山茱萸滋補肝、脾；枸杞子補精，川牛膝補血，菟絲子補腎氣，鹿角膠、龜板膠為血肉有情之品，峻補精髓；紫河車補氣養(yǎng)血，牛骨髓補血益精、止渴、止血，用于精血虧損、虛勞羸瘦之證。全方共奏滋腎補陰、填精益髓、益氣養(yǎng)血之效。本次實驗結(jié)果表明，左歸補髓生血方可改善再障小鼠的一般狀況，顯著提高外周血WBC、RBC、PLT計數(shù)和Hb濃度(P<0.05)，使再障小鼠骨髓增生程度明顯恢復(fù)，造血組織比例明顯增加，并且與司坦唑醇組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示左歸補髓生血方對再障小鼠具有確切的療效。

綜上所述，本研究證實，左歸補髓生血方能夠改善再障模型小鼠的一般狀態(tài)，提升外周血象，抑制骨髓中造血細(xì)胞凋亡，改善并恢復(fù)造血功能，最終達(dá)到治療再障的作用。本研究為臨床應(yīng)用左歸補髓生血方治療再障提供了實驗依據(jù)。