路軼晴

(西安市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安 710002)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)是世界范圍內(nèi)死亡和致殘的主要原因[1]。中國城市人口CAHD發(fā)病率約為1.59%，農(nóng)村人口CAHD發(fā)病率約為0.48%，北方地區(qū)高于南方地區(qū)。雖然，CAHD的病因復(fù)雜，但是，越來越多的研究表明遺傳因素在其發(fā)病中具有重要作用[2]。已有研究證實(shí)，遺傳因素占CAHD易感性個(gè)體差異的40%～60%[3]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一類依賴鋅的內(nèi)肽酶，可以分解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分[4]。MMP異常表達(dá)與多種癌癥和疾病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[5-7]，并且，血清MMP水平可用于疾病的早期診斷[8]。MMP-8可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白，MMP-9可降解Ⅳ型和Ⅴ型膠原蛋白。MMP-8和MMP-9基因有多個(gè)遺傳變異，已被發(fā)現(xiàn)與多種疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[9-10]。然而，對于中國漢族人群中MMP-8和MMP-9基因多態(tài)性與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的研究較少。本研究旨在探討MMP-8和MMP-9基因多態(tài)性與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2016年6月至2017年6月西安市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的CAHD患者為研究對象，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診為CAHD；(2)年齡>18歲；(3)患者之間無血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)其他心腦血管疾病、腫瘤、肝腎疾病、血液病、自身免疫性疾病、呼吸系統(tǒng)及內(nèi)分泌疾病的患者。本研究共納入CAHD患者300例(CAHD組)，男200例，女100例，年齡41～78(55.44±11.35)歲。另選擇同期體檢健康者作為對照，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)以體檢結(jié)果為準(zhǔn)，身體健康，資料信息完善；(2)既往無腫瘤、慢性疾病、嚴(yán)重代謝性疾病及內(nèi)分泌失調(diào)等病史；(3)年齡>18歲；(4)受試者之間無血緣關(guān)系。本研究共納入健康者300例(對照組)，男198例，女102例，年齡42～79(57.26±10.98)歲。2組受試者的性別和年齡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已獲得所有受試者知情同意，符合倫理學(xué)規(guī)定，并通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器全血DNA純化試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，iPLEX Gold 試劑盒、MassARRAY質(zhì)譜儀、MassARRAY RS1000軟件(美國Sequenom公司)，GeneAmp 9700聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(美國ABI公司)；SNPStats在線軟件(西班牙加泰羅尼亞腫瘤研究所)，Haploview 4.2軟件(美國懷特海德生物醫(yī)學(xué)研究所)。

1.3血樣采集及DNA提取采集每位受試者外周靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，現(xiàn)場編號并登記姓名，所有標(biāo)本采集當(dāng)天送回實(shí)驗(yàn)室，置于-70 ℃冰箱保存，以備DNA提取。采用全血DNA純化試劑盒進(jìn)行DNA提取，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4基因分型從美國國立生物技術(shù)信息中心和HapMap數(shù)據(jù)庫中查詢MMP-8和MMP-9基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)，選擇在中國人群具有較高頻率的位點(diǎn)(最小等位基因頻率≥5%)，最終確定了rs1940475、rs11225394、rs11225395、rs3918249、rs3918254和rs3787268共6個(gè)位點(diǎn)。采用MassARRAY SNP 基因分型技術(shù)對所選擇的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型。單堿基延伸引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行設(shè)計(jì)和合成。反應(yīng)在MassARRAY質(zhì)譜儀中進(jìn)行，基因分型使用MassARRAY RS1000軟件進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，直接計(jì)數(shù)各位點(diǎn)的等位基因及基因型頻數(shù)，2組各位點(diǎn)的等位基因頻率分布比較采用χ2檢驗(yàn)；應(yīng)用SNPStats在線軟件(http：//bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm)評估各SNP位點(diǎn)基因型與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性[11]；以相對優(yōu)勢比(odds ratio，OR)和95%可信區(qū)間(confidence intervals，CI)表示SNP與患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系；使用Haploview 4.2軟件評估位點(diǎn)間的連鎖不平衡情況，并進(jìn)行單體型與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1候選SNP基本信息MMP-8和MMP-9基因上6個(gè)候選SNP位點(diǎn)的基本信息見表1。6個(gè)位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。MMP-8基因上的rs11225394位點(diǎn)的等位基因T與降低CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性(OR=0.812，95%CI：0.699～0.932，P=0.033)。MMP-9基因上的rs3918249和rs3787268位點(diǎn)的等位基因T和A與降低CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性(rs3918249：OR=0.734，95%CI：0.613～0.998，P=0.035；rs3787268：OR=0.824，95%CI：0.693～0.978，P=0.024)。

表1 MMP-8和MMP-9基因上6個(gè)候選SNP的基本信息Tab.1 Essential information of six candidate SNPs in MMP-8 and MMP-9 genes

2.2候選SNP在遺傳模型下與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性結(jié)果見表2、表3、表4、表5、表6和表7。在最佳模型顯性模型下，rs11225394位點(diǎn)的C/T和T/T基因型與降低CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性(OR=0.760，95%CI：0.600～0.970，P=0.025)；rs3918249位點(diǎn)的T/C和T/T基因型與降低CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性(OR=0.720，95%CI：0.570～0.910，P=0.005)；rs3787268位點(diǎn)的A/G和A/A基因型與降低CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性(OR=0.740，95%CI：0.590～0.940，P=0.014)。

表2 遺傳模型下rs1940475與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性Tab.2 Correlation between rs1940475 and the risk of CAHD in genetic models

表3 遺傳模型下rs11225394與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性Tab.3 Correlation between rs11225394 and the risk of CAHD in genetic models

表4 遺傳模型下rs11225395與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性Tab.4 Correlation between rs11225395 and the risk of CAHD in genetic models

表5 遺傳模型下rs3918249與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性Tab.5 Correlation between rs3918249 and the risk of CAHD in genetic models

表6 遺傳模型下rs3918254與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性Tab.6 Correlation between rs3918254 and the risk of CAHD in genetic models

表7 遺傳模型下rs3787268與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性Tab.7 Correlation between rs3787268 and the risk of CAHD in genetic models

2.3候選SNP單體型與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性對所選擇的6個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的連鎖不平衡分析，并構(gòu)建單體型，結(jié)果顯示，MMP-9基因上的rs3918249、rs3918254和rs3787268位點(diǎn)具有強(qiáng)連鎖關(guān)系，見圖1。經(jīng)過單體型與CAHD風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CCA單體型與降低CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性(OR=0.640，95%CI：0.340～0.950，P=0.026)，見表8。

圖1 MMP-9基因上3個(gè)候選SNP的連鎖不平衡圖Fig.1 Linkage disequilibrium diagram of the three candidate SNPsin MMP-9 gene

表8 MMP-9基因候選SNP的單體型與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性Tab.8 Correlation between haplotype of candidate SNPs in MMP-9 gene and the risk of CAHD

3 討論

CAHD發(fā)病率較高，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，主要分為環(huán)境因素和遺傳因素。遺傳因素在其發(fā)病中具有重要作用，而CAHD相關(guān)SNP風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的鑒定有助于CAHD高危人群的早期篩查。本研究共挑選了MMP-8和MMP-9基因上的6個(gè)SNP位點(diǎn)并檢測其多態(tài)性，研究其與CAHD風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

MMP是一類鋅依賴型蛋白水解酶家族，可參與形態(tài)發(fā)生、傷口愈合、組織修復(fù)和損傷反應(yīng)等過程。MMP-8也稱為膠原酶-2或嗜中性粒細(xì)胞膠原酶，可由多種細(xì)胞表達(dá)，如成熟的嗜中性粒細(xì)胞、外周嗜中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等。MMP-8在炎癥疾病中起重要作用[12]。MMP-8通過破壞三重螺旋毛細(xì)血管膠原蛋白而引發(fā)膠原蛋白降解的第1步。此外，MMP-8也對血管緊張素Ⅰ具有蛋白水解活性。FANG等[13]報(bào)道MMP-8能裂解血管緊張素Ⅰ，并將其轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，后者又誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血小板或內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1而促進(jìn)血管生成。本研究結(jié)果顯示，MMP-8基因上的rs11225394位點(diǎn)的等位基因T與降低CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性，這是首次報(bào)道該基因位點(diǎn)與CAHD的相關(guān)性，由此推測，rs11225394位點(diǎn)的等位基因C突變?yōu)門可能影響MMP-8的功能，從而參與CAHD的相關(guān)發(fā)病機(jī)制；這仍有待于進(jìn)一步的探索。

MMP-9是細(xì)胞外基質(zhì)代謝酶，研究表明，其表達(dá)與動(dòng)脈硬化斑塊形成密切相關(guān)[14]。MMP-9會導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜侵入和遷移，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)斑塊的形成[15]。一項(xiàng)前瞻性研究顯示，Ⅱ型糖尿病患者M(jìn)MP-9水平明顯升高，而治療后血清MMP-9水平顯著降低，此外，血清MMP-9水平與Gensini評分呈正相關(guān)，提示MMP-9水平與冠狀動(dòng)脈狹窄有關(guān)[16]。因此，MMP-9可能是與胰島素相關(guān)心血管疾病發(fā)生、發(fā)展?jié)撛谙嚓P(guān)的危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，MMP-9基因上的rs3918249和rs3787268位點(diǎn)的等位基因T和A也與降低CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性，說明MMP-9與CAHD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，然而其具體機(jī)制有待深入研究。

本研究對MMP-8和MMP-9基因上的6個(gè)SNP進(jìn)行分型，這些位點(diǎn)在文獻(xiàn)中也曾被報(bào)道與多種疾病具有相關(guān)性。其中rs11225394和rs3918254與中國漢族人群股骨頭壞死風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[17-19]。而本研究首次報(bào)道rs11225394與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，但是，該結(jié)果需要在更大樣本量中進(jìn)一步證實(shí)。rs1940475被發(fā)現(xiàn)與社區(qū)獲得性肺炎相關(guān)的膿毒癥和高加索人群的炎癥反應(yīng)有關(guān)[20-21]。rs11225395與波蘭人群中的膀胱癌患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[22]。而rs3918249被檢測出與中國漢族人群原發(fā)性閉角型青光眼的患病風(fēng)險(xiǎn)和墨西哥兒童的哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[23-24]。rs3787268與美國原住民婦女乳腺癌預(yù)后顯著相關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，rs3918249和rs3787268位點(diǎn)與降低CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性，并且，由rs3918249、rs3918254和rs3787268位點(diǎn)組成的CCA單體型與降低CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明MMP-8基因上的rs11225394位點(diǎn)和MMP-9基因上rs3918249和rs3787268位點(diǎn)可能是CAHD相關(guān)的保護(hù)性位點(diǎn)。MMP-9基因上rs3918249、rs3918254和rs3787268等3個(gè)位點(diǎn)組成的CCA單體型與降低CAHD風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性。本研究首次揭示了MMP-8和MMP-9基因多態(tài)性與CAHD患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，為后續(xù)深入研究MMP與心血管疾病的關(guān)系提供了新線索。