郭路陽，范 蕊，肖愛菊，曹麗佳，石太新，趙東菊，李培嶺

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，河南 衛(wèi)輝 453100；2.安陽市婦幼保健院兒科，河南 安陽 455000)

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenic，ITP)是兒童常見的出血性疾病之一，具有自限性[1]。其發(fā)病主要原因是細(xì)胞和體液免疫介導(dǎo)的血小板過度破壞、巨核細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量異常導(dǎo)致血小板生成不足[2]。近年來，學(xué)者對自身免疫性疾病、腫瘤及心腦血管疾病的表觀遺傳學(xué)進(jìn)行了大量研究，尤其是在DNA甲基化、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)方面[3-4]。DNMT是催化并維持DNA甲基化過程的一類酶。有研究表明，DNMT的異常表達(dá)與自身免疫性疾病等密切相關(guān)，DNA甲基化水平的改變可以影響T細(xì)胞基因表達(dá)，從而改變免疫功能，促進(jìn)狼瘡樣疾病和其他形式的自身免疫性疾病的發(fā)展[5]。本課題組前期已進(jìn)行了急性、持續(xù)性及慢性ITP患兒外周血淋巴細(xì)胞的DNMT mRNA表達(dá)的研究[6-7]。本研究通過檢測血清中DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討DNMTs在兒童ITP中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2015年5月至2016年5月于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的新診斷急性ITP患兒60例作為觀察組，其中男34例，女26例，年齡為1個月4天至12歲，平均(37.4±31.5)個月；根據(jù)文獻(xiàn)[8]將患兒分為<1歲組、1～5歲組和>5歲組。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合新診斷ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]；(2)經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)檢查證實(shí)為ITP；(3)年齡<14歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他原因引起的繼發(fā)性血小板減少；(2)有明確感染病因或藥物接觸病史；(3)4周內(nèi)有輸血史、糖皮質(zhì)激素及疫苗接種史；(4)4周內(nèi)有應(yīng)用維生素B12、B6及葉酸史。選擇同期于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的正常兒童36例作為對照組，其中男25例，女11例，年齡為1個月27天至12歲3個月，平均(33.5±16.0)個月。對照組入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)2周內(nèi)無感染史；(2)4周內(nèi)無糖皮質(zhì)激素、輸血及疫苗接種史；(3)4周內(nèi)未應(yīng)用維生素B12、B6及葉酸。2組兒童年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，血液標(biāo)本采集獲得患兒家屬的知情同意。

1.2方法觀察組患者于就診當(dāng)日、對照組受試者于體檢當(dāng)日無菌采集靜脈血2 mL，靜置20～30 min，3 000 r·min-1離心20 min，收集血清并分裝至EP管中，-80 ℃冰箱存儲備檢。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測2組受試者血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。

2 結(jié)果

2.12組受試者血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表達(dá)水平比較結(jié)果見表1。觀察組患兒血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表達(dá)水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 2組受試者血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of the expression of DNMT1，DNMT3a and DNMT3b protein in serum between the two groups

2.2觀察組不同年齡段患兒血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白水平比較結(jié)果見表2。不同年齡段患兒血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 觀察組不同年齡段患兒血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of the expression of serum DNMT1，DNMT3a and DNMT3b protein in children of different age in the observation group

2.3觀察組不同性別患兒血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白水平比較結(jié)果見表3。男性與女性患兒血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 不同性別患兒血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表達(dá)水平比較Tab.3 Comparison of the expression of DNMT1，DNMT3a and DNMT3b protein in serum between male and female children in observation group

2.4觀察組患兒血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表達(dá)水平的關(guān)系Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，觀察組患兒血清DNMT1與DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)水平無相關(guān)性(r=-0.025、-0.057，P=0.851、0.665，P>0.05)；DNMT3a與DNMT3b蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.259，P=0.046)

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，表觀遺傳學(xué)逐漸成為一個新的研究領(lǐng)域。表觀遺傳學(xué)強(qiáng)調(diào)的是細(xì)胞核的遺傳不依賴于DNA堿基序列的改變[9]，此種表型變化具有可逆性，為疾病的治療及預(yù)防提供了一種可能性。DNMT是催化DNA甲基化的重要生物酶，DNMT的異常激活與表達(dá)可導(dǎo)致DNA的甲基化異常。DNMT主要有DNMT1、DNMT3a和DNMT3b，DNMT1的主要作用是維持DNA甲基化，DNMT3a和DNMT3b主要負(fù)責(zé)從頭甲基化[10]。

DNMT的低表達(dá)可導(dǎo)致DNA低甲基化，從而在T淋巴細(xì)胞的激活、炎性因子的釋放、激活自身免疫反應(yīng)等過程中發(fā)揮作用，進(jìn)而參與了ITP的發(fā)病[11]。有學(xué)者對ITP患兒外周血全局表達(dá)譜進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，與ITP相關(guān)的幾種基因在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中亦有表達(dá)，這表明ITP與其他自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)聯(lián)[12]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，在ITP的DNMT3b基因啟動子中，白細(xì)胞介素-1受體1型(interleukin-1 receptorⅠ，IL1R1)內(nèi)含子-2和rs2424913單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)(C46359T)相關(guān)聯(lián)，IL1R1可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性和rs2424913 DNMT3B SNP在兒童期ITP中有較高的頻率，這些遺傳標(biāo)志物的出現(xiàn)提示DNMT可能參與了ITP的發(fā)病[13]。

ITP是自身免疫性疾病，病因仍不清楚，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在成人ITP的發(fā)病中存在著DNA低甲基化[14]，而DNMT是催化DNA甲基化的關(guān)鍵生物酶，但關(guān)于DNMT與兒童ITP的關(guān)系，目前相關(guān)研究不多。本課題組前期已進(jìn)行了急性、持續(xù)性、慢性ITP患兒外周血淋巴細(xì)胞中DNMT mRNA表達(dá)的研究，結(jié)果顯示，ITP患兒外周血淋巴細(xì)胞可能存在DNA低甲基化模式[6-7]。本研究進(jìn)一步檢測ITP患兒外周血清中DNMT的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新診斷ITP患兒血清中DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組，提示新診斷ITP患兒可能存在DNMT低表達(dá)。但引起其低表達(dá)的具體原因尚不清楚，考慮某些因素如感染等作用于DNMT，使其表達(dá)下降，進(jìn)而引起DNA低甲基化，從而引起白細(xì)胞介素6、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原等體內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)增加，導(dǎo)致體內(nèi)免疫紊亂，參與ITP的發(fā)病。有研究發(fā)現(xiàn)，DNMT的表達(dá)量和活性的改變均參與調(diào)控DNA甲基化水平[15]。因此，考慮DNMT對DNA甲基化的調(diào)控作用主要是通過與啟動子的結(jié)合、DNMT酶的含量及活性的改變等作用而實(shí)現(xiàn)的。

DNA甲基化及DNMT在人的生長發(fā)育中是動態(tài)變化的，并且起著重要作用[16]。DELSANTE等[17]研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1的表達(dá)與年齡有關(guān)，XU等[18]研究顯示，DNA甲基化水平隨著年齡的增長呈下降趨勢。另有研究發(fā)現(xiàn)，慢性ITP的發(fā)生與初診時的年齡有關(guān)，初診時發(fā)病年齡越大，進(jìn)展為慢性ITP的可能性就越大[8，19]。但亦有研究發(fā)現(xiàn)，風(fēng)濕性心臟病患者中DNMT的表達(dá)與年齡無明顯相關(guān)性[20]?？傊?，關(guān)于年齡與DNMT表達(dá)的關(guān)系目前的研究結(jié)果尚不一致。本研究對患者初診時的年齡進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，不同年齡段患兒血清DNMT1、DNMT3a及DNMT3b蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述研究結(jié)果存在不一致的原因可能為年齡分組范圍不一致、樣本量較少、個體差異等。

既往有研究認(rèn)為，DNA甲基化水平在性別間無差異[21-22]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，女性DNA甲基化水平低于男性[23]，還有研究認(rèn)為，DNMT3b蛋白表達(dá)水平在不同性別中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[24]。本研究結(jié)果顯示，新診斷ITP患兒血清DNMT蛋白表達(dá)水平在男、女患兒間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在自身免疫性疾病、腫瘤、胚胎發(fā)育及心腦血管疾病中，DNMT表達(dá)異?？赏ㄟ^多途徑參與發(fā)病[25]。機(jī)體正常DNA甲基化狀態(tài)的維持是通過DNMT家族相互協(xié)調(diào)、共同維持，而不是單獨(dú)發(fā)揮作用[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中[27]，當(dāng)敲除DNMT3b基因時，僅可降低3%的甲基化水平，同時敲除DNMT1和DNMT3b后，則可降低95%的甲基化水平。本研究結(jié)果顯示，新診斷ITP患兒血清DNMT3a與DNMT3b存在正相關(guān)關(guān)系，推測在ITP患兒DNA甲基化過程中DNMT3a與DNMT3b存在相互協(xié)調(diào)作用，但其在促進(jìn)甲基化中的作用是微弱的；而DNMT1與DNMT3a、DNMT1與DNMT3b蛋白表達(dá)之間均無相關(guān)性，可能是因?yàn)樵摷膊樽韵扌粤夹约膊?，有自愈轉(zhuǎn)歸的可能。

綜上所述，ITP患兒血清DNMTl、DNMT3a及DNMT3b蛋白表達(dá)水平降低，可能通過參與低甲基化，進(jìn)而參與了兒童ITP的發(fā)病。在兒童ITP的DNA甲基化過程中，DNMT可能起一定的協(xié)同作用，但DNMT作為DNA甲基化的關(guān)鍵酶，其活性降低亦可導(dǎo)致DNA甲基化水平降低，故還需對DNMT的活性做進(jìn)一步研究。