王倩楠，唐成和，石計朋，尚 云

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院新生兒科，河南 衛(wèi)輝 453100)

缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE) 是圍產期多種原因造成缺氧與腦血流減少而引起的新生兒腦部受損[1]，導致高病死率和長期神經功能障礙。亞低溫治療是唯一被證明對HIE有確切療效的方法，一般認為出生后6 h內為最佳的治療時間窗[2]。臨床上許多HIE患兒錯過了最佳治療時機，對該類患兒應用亞低溫治療是否仍有腦保護作用，臨床認識尚不統(tǒng)一。同時免疫炎癥在HIE中的作用日益受到重視，因此本研究以出生后6～12 h的HIE患兒為研究對象，通過觀察治療前后新生兒神經行為測定(neonatal behavioral neurological assessment，NBNA)評分及外周血 調節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)和白細胞介素-17(interleukin 17，IL-17)表達的變化，探討延長亞低溫治療時間窗的可行性及免疫炎癥在其中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2015年11月至2017年9月新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院新生兒科收治的中、重度HIE患兒為研究對象。納入標準：(1)所有患兒均符合HIE診斷標準[3]；(2)均在出生后 6～12 h內入院治療，出生體質量2.5～4.0 kg，37周≤胎齡<42周；(3)出生后1 min Apgar評分≤3，5 min Apgar評分≤5。排除標準：(1)嚴重先天畸形；(2)顱腦創(chuàng)傷或中、重度顱內出血；(3)血小板<50×109L-1；(4)嚴重感染性疾病等。該研究共納入HIE患兒39例，根據患兒治療方法不同分為亞低溫組和對照組。對照組18例，男10例，女8例；胎齡37.0～41.2(38.4±1.3)周；出生體質量1.63～4.05(3.22±0.61)kg；中度HIE 10例，重度HIE 8例。亞低溫組21例，男12例，女9例；胎齡37.0～41.0(38.7±1.2)周；出生體質量2.50～4.39(3.26±0.60)kg；中度HIE 12例，重度HIE 9例。2組患兒的性別、胎齡、出生體質量和病情程度比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患兒監(jiān)護人均簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器流式細胞分析用溶血素、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的鼠抗人CD4、別藻青蛋白(allophycocyanin，APC)標記的鼠抗人CD25、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記的鼠抗人CD127、人Th1/Th2/Th17細胞因子試劑盒和流式細胞儀均購自美國BD公司。

1.3治療方法對照組患兒采用常規(guī)支持治療，如糾正低血壓、低氧血癥和代謝性酸中毒等。亞低溫組患兒在常規(guī)支持治療的基礎上加用全身亞低溫治療，患兒盡量裸露并遠離一切加溫設施，置于自動調控的冰毯上，開始誘導降溫時速度要快，要求在 1～2 h達到目標溫度，將直腸溫度控制在33.5～34.5 ℃，持續(xù)治療72 h，隨后給予自然復溫，一般復溫速度為每2 h升高1 ℃，至少持續(xù)6 h后再恢復到正常體溫。亞低溫治療期間密切觀察患兒的神經系統(tǒng)表現(xiàn)，動態(tài)監(jiān)測患兒血壓、呼吸、電解質和凝血功能等。如果在此過程中出現(xiàn)嚴重不良反應則立即終止亞低溫治療。

1.42組患兒血Treg細胞檢測治療前及治療 72 h 后抽取各組新生兒靜脈血1 mL于抗凝采血管中，24 h 內完成檢測；上樣管中加入CD4、CD25和CD127抗體各3 μL，全血40 μL，混勻后避光孵育15 min；加入1 mL溶血素，混勻后避光靜置15 min；3 000 r·min-1離心5 min；棄上清液后加入1 mL鞘液洗滌2次；0.5 mL鞘液重懸后用流式細胞儀檢測。以CD4+細胞設門，分析CD4+CD25+CD127lowTreg細胞占CD4+細胞的百分比[4]。

1.52組患兒血IL-17水平檢測治療前及治療72 h后抽取各組患兒外周靜脈血1 mL置于含有促凝劑的采血管中，待血液凝固后 3 000 r·min-1離心 5 min，取40 μL血清，依照試劑說明書方法處理樣本，用流式細胞儀檢測細胞因子，結果用FCAP Array軟件分析。

1.6新生兒神經功能評價入組患兒均采用NBNA評分，于出生后14、28 d，以20項新生兒行為神經測查法為標準，從行為能力、被動肌張力、主動肌張力、原始反射和一般評估等5個方面進行測評，滿分為40分，≥35分表示患兒的行為神經功能正常，<35分表示新生兒的行為神經功能異常。

2 結果

2.12組患兒血Treg細胞及IL-17水平比較結果見表1。治療前，亞低溫組與對照組中、重度HIE患兒血Treg細胞、IL-17水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療72 h后，對照組中、重度HIE患兒及亞低溫組重度HIE患兒血Treg細胞、IL-17水平與治療前比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。亞低溫組中度HIE患兒血Treg細胞水平顯著高于治療前及對照組中度HIE患兒，IL-17水平顯著低于治療前及對照組中度HIE患兒，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；亞低溫組重度HIE患兒血Treg細胞、IL-17水平與對照組重度HIE患兒治療后比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 2組患兒治療前后血Treg細胞及IL-17水平比較Tab.1 Comparison of the levels of peripheral blood Treg cell and IL-17 between the two groups before and after treatment

2.22組患兒NBNA評分比較結果見表2。出生后14、28 d，亞低溫組中度HIE患兒的NBNA評分顯著高于對照組中度HIE患兒，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；亞低溫組與對照組重度HIE患兒的NBNA評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 2組患兒不同時間NBNA評分比較Tab.2 Comparison of NBNA score between the two groups at different time

3 討論

亞低溫治療HIE有顯著的神經保護作用[5]，Meta分析已證實，亞低溫能顯著降低足月HIE患兒的病死率和遠期神經系統(tǒng)疾病發(fā)生率[6]。許多國家已將亞低溫治療列為新生兒HIE的常規(guī)治療方法，有效降溫也已列入新生兒窒息復蘇后的常規(guī)管理辦法[2]。亞低溫干預的最佳時期是在出生后 6 h 之內，但臨床上有部分患兒由于各種原因錯過了最佳的治療時機。LI等[7]研究認為，出生后6～10 h 開始亞低溫治療是有效的。也有研究發(fā)現(xiàn)，延遲至6～12 h開始亞低溫治療可能仍有效[8-9]。最近美國一項多中心臨床研究發(fā)現(xiàn)，HIE患兒生后6～24 h開始亞低溫治療可以降低患兒18個月內死亡或殘疾的風險，但最終指出效果仍不確定[10]。這些研究表明，超過最佳治療時間窗進行亞低溫治療也有一定的腦保護作用，但目前尚存在爭論。本研究結果顯示，出生后14、28 d，亞低溫組中度HIE患兒NBNA評分較對照組中度HIE患兒高，而2組之間重度HIE患兒NBNA評分比較差異無統(tǒng)計學意義，提示中度HIE患兒出生后6～12 h行亞低溫治療可能仍然有效，而對重度HIE患兒效果不明顯，這可能是因為嚴重的缺氧缺血導致在亞低溫治療介入前二次能量衰竭已經發(fā)生。

免疫反應和炎癥在新生兒HIE中發(fā)揮了重要作用[11]。缺氧缺血引起血管內炎癥級聯(lián)反應，同時應激或死亡的神經元引起腦固有免疫細胞的活化以及外周免疫細胞的腦浸潤，這些免疫細胞通過釋放神經毒性物質(如活性氧和炎性細胞因子等)最終導致了繼發(fā)性神經元死亡[12]。亞低溫治療不僅可以減少腦細胞的代謝率，還能抑制免疫反應，進而起到神經保護作用[13]。Treg細胞通過細胞間的直接接觸和分泌細胞因子來發(fā)揮抗炎作用。Treg細胞能有效抑制自身免疫反應，是維持免疫穩(wěn)態(tài)和限制炎性損傷的關鍵因素[14]。IL-17主要由Th17細胞分泌，炎癥早期許多固有免疫細胞也能迅速分泌IL-17，是典型的促炎細胞因子。IL-17通過活化絲裂原活化蛋白激酶途徑和核轉錄因子-κB途徑促進促炎性分子的產生，進而導致?lián)p傷部位炎性細胞浸潤和壞死[15]。在免疫炎癥反應中，存在Treg/Th17失衡[16]。在缺血性腦卒中患者中，存在IL-17升高和Treg細胞降低[17-18]。有研究表明，在新生兒HIE中，腦損傷程度與外周血中IL-17水平呈正相關，與Treg細胞水平呈負相關[19]。本研究結果顯示，治療72 h后，各組HIE患兒血Treg細胞均較治療前升高，IL-17水平均較治療前降低，但僅亞低溫組中度HIE患兒治療后血Treg細胞及IL-17水平與治療前及對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，因此，6～12 h開始亞低溫治療可能通過維持較高的Treg細胞比例調節(jié)免疫反應抑制炎癥，同時通過抑制IL-17等促炎性細胞因子及其誘導的炎癥級聯(lián)反應來降低腦損傷，但在重度HIE患兒中這一效果并不明顯。

綜上所述，亞低溫治療對出生后6～12 h的中度HIE患兒仍具有腦保護作用，通過刺激Treg細胞的生成和抑制促炎性細胞因子IL-17發(fā)揮腦保護作用。由于本研究觀察時間短、樣本量較少，后期需要納入更多的樣本及延長觀察時間，來觀察延長亞低溫治療時間窗的療效與安全性，以使更多的患兒受益于亞低溫治療。