長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長達(dá)200個(gè)核苷酸以上的RNA轉(zhuǎn)錄本,它們不編碼任何蛋白質(zhì)[1]。超保守區(qū)域(ultraconserved regions, UCRs)是存在于基因組中一些DNA序列,在不同物種之間高度保守[2],目前已發(fā)現(xiàn)有481個(gè)>200 bp的基因片段均屬于超保守區(qū)域。在這些超保守區(qū)域中部分可以轉(zhuǎn)錄,它們的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物叫做T-UCRs(transcribed ultraconserved regions,T-UCRs)[3],屬于lncRNA。超保守區(qū)域通常位于癌基因相關(guān)的脆弱位點(diǎn),有文章報(bào)道T-UCRs的表達(dá)水平在人類的膀胱癌[4]、肝癌[5]、結(jié)腸癌[6]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[7]等多類腫瘤中均發(fā)生顯著改變,這些表達(dá)水平發(fā)生變化的T-UCRs是否具有生物學(xué)功能是人們迫切要知道的。近幾年來越來越多的證據(jù)表明，T-UCRs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[8]。

脯氨酸/谷氨酰胺富含性剪接因子(splicing factor proline and glutamine rich,SFPQ)是在脊椎動(dòng)物體內(nèi)廣泛表達(dá)的核蛋白[9],它在調(diào)控哺乳動(dòng)物的晝夜節(jié)律方面發(fā)揮重要作用[10]。同時(shí)也是體內(nèi)重要的抑癌蛋白, SFPQ可通過下調(diào)泛素樣蛋白LC3B來增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡[11]。也有文獻(xiàn)報(bào)道,它與lncRNA NEAT-1結(jié)合調(diào)控體內(nèi)免疫應(yīng)答[12];與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)結(jié)合,上調(diào)多嘧啶串結(jié)合蛋白2(PTBP2)的表達(dá)水平,從而促進(jìn)直腸癌腫瘤生長與轉(zhuǎn)移[13]。在小鼠體內(nèi),SFPQ通過與非編碼RNA Vl30特異性結(jié)合來調(diào)控下游基因的表達(dá)水平[14]。人SFPQ基因位于1號(hào)染色體上,全長9533 bp,鼠的SFPQ基因位于4號(hào)染色體,全長9935 bp。兩者均由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成,在該基因的第9號(hào)外顯子和第10號(hào)外顯子之間的內(nèi)含子中,有一段超保守序列,編碼產(chǎn)物為uc.12+A。關(guān)于uc.12+A是否具有生物學(xué)功能及其與SFPQ之間是否具有調(diào)控作用目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

由于uc12+A是轉(zhuǎn)錄自SFPQ基因的反義鏈,因此本文擬采用鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(strand-specific RT-PCR)的實(shí)驗(yàn)方法檢測uc.12+A在B淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá),同時(shí)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot技術(shù)檢測SFPQ在B淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況,以了解兩者在B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng):小鼠B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株(38B9和myc3)由本實(shí)驗(yàn)室提供。分別用DMEMF-12培養(yǎng)基,α-MEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清、1%青-鏈霉素,在37 ℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。利用CD19磁珠抗體從小鼠脾臟中分選正常B細(xì)胞。

1.1.2 試劑與儀器設(shè)備: TRIzol(Invitrogen公司);三氯甲烷、異丙醇(中國恒利試劑化學(xué)試劑公司); DEPC(上海生物工程有限公司);無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(TakaRa公司)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。SFPQ抗體(Millipore,美國); GAPDH 抗體(Vazyme,中國);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天,中國);冷凍離心機(jī)(Thermo,美國);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo,美國);核酸蛋白定量儀(Eppendorf,美國);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI,美國)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì):在ucbase、pubmed數(shù)據(jù)庫中分別查出uc.12+A、小鼠SFPQ的基因序列,設(shè)計(jì)鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和定量PCR引物。見表1，2。

表1 鏈特異性逆轉(zhuǎn)錄引物

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.2.2 strand-specific RT-PCR檢測uc.12+A、SFPQ表達(dá)。

1.2.2.1 sfrand-specific RT-PCR:使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn),取1μg 38B9和myc3的總RNA分別加入0.2 mL離心管中,進(jìn)行去除基因組DNA純化。隨后使用鏈特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。37 ℃逆轉(zhuǎn)錄15 min,85 ℃滅活5 s,待降溫至4 ℃時(shí)取出,用RNase free H2O五倍稀釋,-20 ℃冰箱保存。

1.2.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR:取稀釋后的cDNA 2μL,SYBRⅡ10μl,上游引物和下游引物各0.5μL,Rox 0.4μL,RNase free H2O 6μL加入8連管,每個(gè)樣本加3個(gè)復(fù)孔,混勻, 用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測樣本。反應(yīng)條件:第一步:95 ℃;第二步:95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);第三步:95 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,95 ℃ 30s。

1.2.3 Western Blot 檢測SFPQ表達(dá):收取細(xì)胞,加入蛋白裂解液(含磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑)提取蛋白,用BCA法進(jìn)行蛋白定量,按每孔40μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為10%。采用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%BSA室溫封閉2 h,加SFPQ抗體(稀釋濃度1∶1000),4 ℃孵育過夜, 二抗室溫孵育1 h(稀釋濃度為1∶10000),使用化學(xué)發(fā)光成像分析儀顯影成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及Spearson相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 uc.12+A在小鼠B淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá) 使用鏈特異性引物時(shí),uc.12+A的表達(dá)比用普通的隨機(jī)引物低,兩種檢測方法中uc.12+A在B淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)均高于正常B細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖1。

2.2 SFPQ在小鼠B淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)

2.2.1 SFPQ基因表達(dá)水平:SFPQ在小鼠B淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

2.2.2 SFPQ蛋白表達(dá)水平:SFPQ在B淋巴瘤細(xì)胞株中蛋白水平明顯高于正常B細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.3 uc.12+A與SFPQ在B淋巴瘤細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)性 分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩者呈顯著正相關(guān)(R2=0.8354)。

注:**P<0.01;A:普通RT-PCR;B:strand-specific RT-PCR圖1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測uc.12+A在B淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)

注:**P<0.01圖2 普通RT-PCR檢測SFPQ在B淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)

注:*P<0.05;A:western blot 電泳圖; B:灰度值分析統(tǒng)計(jì)圖圖3 Western blot 檢測SFPQ蛋白在B淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

lncRNA不編碼蛋白質(zhì),但會(huì)表現(xiàn)出類似mRNA的結(jié)構(gòu)特征,例如外顯子基因結(jié)構(gòu)和poly(A)尾巴，具有組織學(xué)和發(fā)育學(xué)特異性的表達(dá)模式。

到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多種在癌組織中表達(dá)出現(xiàn)異常的T-UCRs,其對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。然而超保守RNA有的在正義鏈上表達(dá),有的在反義鏈上表達(dá),使用傳統(tǒng)的RT-PCR方法時(shí),反轉(zhuǎn)錄體系中的所有RNA都充當(dāng)了cDNA的第一鏈模板,無法準(zhǔn)確檢測出正義鏈或反義鏈上的T-UCR的表達(dá)情況。針對(duì)這個(gè)問題,我們用與T-UCR互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為特異性逆轉(zhuǎn)錄引物,取代隨機(jī)六聚體引物進(jìn)行RT-PCR,只產(chǎn)生所需要的cDNA,從而產(chǎn)生更為特異性的PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，來自反義鏈的uc.12+A在B淋巴瘤細(xì)胞株中,sfrand-pecific RT-PCR組表達(dá)比普通RT-PCR組低,但在這2種實(shí)驗(yàn)方法中uc.12+A在38B9和myc3中表達(dá)增高的總趨勢沒有改變。本研究提示,與普通的RT-PCR相比,sfrand-pecific RT-PCR能更精確地檢測T-UCRs的表達(dá)情況,為檢測T-UCRs表達(dá)提供新方法。

SFPQ作為一種抑癌蛋白,已涉及無數(shù)核功能,包括DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、剪接和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)[15],可與dsDNA在許多基因的啟動(dòng)子上相互作用,從而發(fā)揮著控制轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。它也是DNA雙鏈斷裂修復(fù)通路的重要參與者,直接與DNA以及DNA修復(fù)蛋白結(jié)合[16-17],并且迅速定位于細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷部位[23],有數(shù)篇文獻(xiàn)報(bào)道SFPQ與lncRNA結(jié)合,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能。而uc.12+A位于SFPQ蛋白編碼基因的內(nèi)含子上,本研究首先通過sfrand-pecific RT-PCR的方法檢測發(fā)現(xiàn)uc.12+A在B淋巴瘤細(xì)胞中表達(dá)升高,隨后進(jìn)一步檢測其宿主基因SFPQ在同種淋巴瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)SFPQ的表達(dá)趨勢無論在mRNA水平還是蛋白水平上都與uc.12+A一致。初步研究結(jié)果表明,uc.12+A與其宿主基因SFPQ在B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)水平均呈現(xiàn)增高的特點(diǎn),且具有一定相關(guān)性,兩者之間的是否具有相互調(diào)控作用以及其對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展的影響有待進(jìn)一步研究。