王 倬，曾糧斌，袁善奎，李建軍，杜昱光*

(1.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190) (2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205) (3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

幾丁質(zhì)(chitin)，又名甲殼質(zhì)、甲殼素，常見于甲殼類動物、昆蟲外殼以及真菌細(xì)胞壁，是自然界產(chǎn)量僅次于纖維素的天然多糖，年產(chǎn)量約為1011噸[1]。幾丁質(zhì)及其脫乙?；a(chǎn)物殼聚糖(chitosan)因其具有的多種生物活性，良好的生物可降解性及生物相容性，已被作為一種優(yōu)秀的天然材料應(yīng)用于諸多領(lǐng)域。然而，幾丁質(zhì)及殼聚糖較差的水溶性一定程度上限制了其更廣泛的應(yīng)用，其降解得到的低分子量寡糖產(chǎn)物(chitooligosaccharide)水溶性良好，且在抗炎、抗菌、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞修復(fù)、植物免疫誘導(dǎo)等多方面展現(xiàn)出更好的生物活性[1-4]，在醫(yī)藥、食品、化妝品以及農(nóng)業(yè)等諸多行業(yè)展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[5-7]，相關(guān)產(chǎn)業(yè)近些年成長迅速。

1 分類定義

Chitooligosaccharides在中文中通常被稱為殼寡糖、幾丁寡糖或低聚殼聚糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖及其脫乙?；a(chǎn)物氨基葡萄糖組成，是聚合度<20、平均分子量<3.9 kDa的低聚糖鏈[5]。如同其制備原料幾丁質(zhì)與殼聚糖，chitooligosaccharides也常被分為兩類：一類是脫乙酰度(DD)>70%的，通常稱為殼寡糖(chitosan oligosaccharides)，農(nóng)業(yè)上也稱為氨基寡糖素；另一類是脫乙酰度較低，<50%的，稱為幾丁寡糖(chitin oligosaccharides)。這種分類方法很大程度上源于寡糖制備工藝方法局限性。傳統(tǒng)工藝中，因為幾丁質(zhì)不溶于水、堿和有機(jī)溶液，只溶于部分濃酸，因此甲殼類原料首先通過加入強(qiáng)堿脫乙酰生產(chǎn)可溶于稀酸的脫乙酰度>70%的殼聚糖，從而實現(xiàn)工業(yè)上的大規(guī)模制備。以此殼聚糖為原料降解制備殼寡糖的，其脫乙酰度也在這個范圍。隨著對chitooligosaccharide研究的進(jìn)一步深入，這種分類及中文命名方式出現(xiàn)了一些問題，比如對脫乙酰度在50%～70%之間的寡糖缺乏定義，而這類被稱為hetero-chitooligosaccharides的寡糖由于其更優(yōu)的生物活性及物理化學(xué)性質(zhì)，已成為殼寡糖研究領(lǐng)域及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的最新熱點[1,4]?？梢钥闯?，chitooligosaccharide類寡糖的分類及中文命名存在很多定義不清以及命名混淆的狀況。在本文中為便于敘述，我們定義脫乙酰度>70%的為殼寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)；脫乙酰度<50%的為幾丁寡糖(chitin oligosaccharide，CTOS)；脫乙酰度在50%～70%之間的為HT-殼寡糖(hetero-chitooligosaccharide，HT-COS)；而這些寡糖統(tǒng)稱為幾丁類寡糖(chitooligosaccharide)。盡管脫乙酰度是幾丁類寡糖分類的重要依據(jù)，寡糖的聚合度(DP)、分子量(MW)、分子量分布(PD)以及乙酰化分布模式(PA)等結(jié)構(gòu)特征均直接影響幾丁類寡糖的生物活性，并可以依照這些特征進(jìn)行更細(xì)致的分類[8]。

2 生產(chǎn)工藝技術(shù)研發(fā)

目前，幾丁類寡糖主要通過物理、化學(xué)方法或酶法降解殼聚糖或幾丁質(zhì)制備生產(chǎn)。幾丁類寡糖的物理降解研究相對較少，方法主要包括超聲降解[9]及γ-輻照[10]，工業(yè)制備主要通過化學(xué)法及酶法。傳統(tǒng)化學(xué)法制備工藝主要使用強(qiáng)酸降解，包括酸解、中和、分離、干燥等步驟[11]。除了使用強(qiáng)酸降解，雙氧水也可以用于寡糖制備[12]。化學(xué)降解方法步驟較復(fù)雜，且較難控制寡糖產(chǎn)物的聚合度、脫乙酰度等結(jié)構(gòu)特征，其寡糖產(chǎn)物的聚合度較低，而生物活性更優(yōu)的高聚合度寡糖產(chǎn)物較少[11]。此外，還存在副產(chǎn)物較多、環(huán)境不友好等問題。相較而言，酶法制備是更有效、應(yīng)用更廣泛的方法。酶法制備可使用特異性的幾丁質(zhì)酶和殼聚糖酶，也可以使用非特異性的糖苷酶以及蛋白酶。酶法降解具有高效、反應(yīng)溫和、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)可控、環(huán)境友好無污染等優(yōu)點，適用于幾丁類寡糖生產(chǎn)制備。

3 植物免疫誘導(dǎo)活性研究與應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，幾丁類寡糖具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂以及降血壓等多種生理活性[13,14]，在醫(yī)療、保健、食品等領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用(表1)。在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面，幾丁類寡糖因為具有激活植物免疫系統(tǒng)的活性，而被作為植物誘導(dǎo)劑廣泛應(yīng)用(表1)。研究表明，幾丁類寡糖的植物免疫誘導(dǎo)活性受其濃度、聚合度、脫乙酰度、施用方法、植物生長周期等多方面因素影響[15]。幾丁寡糖的植物作用活性研究開展較早，其在植物上的特異性受體也已發(fā)現(xiàn)[16,17]。研究表明，聚合度>3的幾丁寡糖具有較強(qiáng)的植物誘導(dǎo)活性，與相同聚合度的殼寡糖相比活性更好。幾丁寡糖的活性更高的原因或在于其主要由N-乙酰氨基葡萄糖組成，而單糖上的乙?；鶊F(tuán)對于寡糖與受體的結(jié)合至關(guān)重要。因此，更高聚合度的幾丁寡糖往往活性更強(qiáng)。但是，高聚合度(DP>8)的幾丁寡糖在水和有機(jī)溶液中的溶解性均很低，且目前幾丁寡糖生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜，限制了其更廣泛的應(yīng)用。相較而言，殼寡糖在植物免疫誘導(dǎo)活性方面的研究更為深入，在我國已有多種氨基寡糖素類農(nóng)藥獲得了登記許可。殼寡糖的植物免疫誘導(dǎo)作用機(jī)制可能與幾丁寡糖存在差異，其在植物上的特異性受體也尚未發(fā)現(xiàn)。目前認(rèn)為，殼寡糖暴露的氨基所攜帶的正電荷是其活性的重要基礎(chǔ)，殼寡糖或通過此特性與細(xì)胞膜結(jié)合，或進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與核酸結(jié)合影響相關(guān)基因的表達(dá)[15]。盡管殼寡糖的作用機(jī)制尚待更多研究確定，但在多種植物上的研究及應(yīng)用證明，殼寡糖可以促進(jìn)植物生長[18]、激活植物天然免疫系統(tǒng)[6,15]，從而提高植物抗病、抗蟲能力，增強(qiáng)抗逆性(抗旱、抗寒、耐鹽)。此外，在實際應(yīng)用中我們發(fā)現(xiàn)，殼寡糖可以促進(jìn)植物降解農(nóng)藥從而降低農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留。因此殼寡糖作為天然、無毒、環(huán)境友好的新型生物農(nóng)藥、肥料及生長調(diào)節(jié)劑，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。與幾丁寡糖類似，研究發(fā)現(xiàn)聚合度≥3的殼寡糖具有較高的植物免疫誘導(dǎo)活性[19]。

表1 國內(nèi)幾丁類寡糖產(chǎn)品信息匯總

注：*產(chǎn)品分類參照本文分類定義方法；本表數(shù)據(jù)參考農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T2889.1-2016、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HG/T 4926-2016、國家衛(wèi)生計生委公告(2014年第6號)

4 構(gòu)效關(guān)系研究

近期研究表明，脫乙酰度50%及68%的HT-殼寡糖植物誘導(dǎo)活性比傳統(tǒng)殼寡糖更強(qiáng)[20]。目前研究認(rèn)為，HT-殼寡糖既有足夠數(shù)量的乙?；鶊F(tuán)參與植物表面受體結(jié)合，從而更有效的激活植物免疫系統(tǒng)，其所具有的正電荷也可以發(fā)揮殼寡糖的活性作用，同時在較高聚合度(DP>8)的情況下仍具有較好的水溶性，因此已成為幾丁類寡糖最新的研究方向。此外，HT-殼寡糖的脫乙酰化程度更接近于自然界中真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)/殼聚糖的脫乙酰度范圍，這一特征也可能是其優(yōu)良植物免疫誘導(dǎo)活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，因為真菌細(xì)胞壁組分正是植物天然免疫系統(tǒng)的識別信號。然而，這種脫乙酰度范圍也帶來HT-殼寡糖結(jié)構(gòu)上的復(fù)雜性，給HT-殼寡糖的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定帶來挑戰(zhàn)。以脫乙酰度50%的雜殼四糖為例，在聚合度和脫乙酰度相同的情況下，其單體均由2個氨基葡萄糖和2個N-乙酰氨基葡萄糖組成，但從糖鏈還原端到非還原端不同的單糖排列順序可以產(chǎn)生6種不同結(jié)構(gòu)的寡糖單體。這一新的發(fā)現(xiàn)極大增加了幾丁類寡糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性(圖1)。近期研究通過使用特定的幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶及脫乙酰酶，結(jié)合分離純化方法的改進(jìn)，以及質(zhì)譜、NMR等結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)的發(fā)展，制備了種類多樣、結(jié)構(gòu)確定的HT-殼寡糖單體[21,22]，為HT-殼寡糖構(gòu)效關(guān)系的深入研究及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。令人驚訝的是，體外植物細(xì)胞活性實驗表明，僅僅一個乙?；稽c不同，這些寡糖同分異構(gòu)體的生物活性相差很大[23]。我們近期也開發(fā)了基于特定酶的幾丁類寡糖綠色清潔化生產(chǎn)工藝，制備了聚合度、脫乙酰度、乙酰化分布模式可控，結(jié)構(gòu)明確的HT-殼寡糖及幾丁寡糖。室內(nèi)及田間試驗表明，這些寡糖展現(xiàn)出良好的植物免疫誘導(dǎo)活性，其免疫誘導(dǎo)抗病、抗蟲活性是傳統(tǒng)高脫乙酰度殼寡糖產(chǎn)品的數(shù)倍。

圖1 幾丁類寡糖結(jié)構(gòu)特征示意圖

5 討論

綜上所述，幾丁類寡糖在健康產(chǎn)業(yè)、農(nóng)業(yè)等方面已顯現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價值，以聚合度為主要特征的第一代高脫乙酰度(DD>70%)殼寡糖產(chǎn)品在多個領(lǐng)域被成功開發(fā)，在農(nóng)業(yè)應(yīng)用上已有60多種氨基寡糖素農(nóng)藥獲得登記證。然而，目前幾丁類寡糖產(chǎn)品類型單一，所開發(fā)的農(nóng)藥、飼料添加劑及功能食品產(chǎn)品均屬于本文所述殼寡糖的范疇(表1)。此外，目前產(chǎn)品結(jié)構(gòu)表征相對不足，一般僅對聚合度和脫乙酰度有較為籠統(tǒng)的限定，造成相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量水平良莠不齊。越來越多的研究表明，寡糖的生物活性受聚合度、脫乙酰度、乙?；植寄Ｊ降冉Y(jié)構(gòu)特征的影響而產(chǎn)生巨大差別。因此，對于殼寡糖類產(chǎn)品需要更科學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)表征及分類規(guī)范。HT-殼寡糖因其結(jié)構(gòu)與天然免疫誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)更近似帶來高活性特點，目前隨著綠色清潔化可控酶解制備工藝的成熟，第二代聚合度可控，脫乙酰度范圍更接近自然狀況的殼寡糖類產(chǎn)品即將面世。而隨著定點脫乙?；夹g(shù)的不斷成熟及制備、檢測技術(shù)的完善，未來還將出現(xiàn)三大結(jié)構(gòu)特征明確可控(即聚合度、脫乙酰度、乙?；稽c)的第三代殼寡糖類產(chǎn)品。這些寡糖產(chǎn)品對制備技術(shù)提出了更高、更科學(xué)的要求，但也將具有更廣闊的應(yīng)用前景。