孟贊 唐櫟

摘 要： 目的：體外培養(yǎng)高純度的少突膠質(zhì)細(xì)胞。方法：取SD乳鼠腦皮質(zhì)，用增殖培養(yǎng)基聯(lián)合EDTA消化機(jī)械吹打分離純化法培養(yǎng)純化；光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；純化培養(yǎng)3d后免疫熒光染色鑒定細(xì)胞類型。結(jié)果：獲得高純度的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞以及成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞免疫熒光A2B5標(biāo)記陽性，成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光MBP標(biāo)記陽性。結(jié)論：用增殖培養(yǎng)基聯(lián)合EDTA消化機(jī)械吹打分離純化法可以得到高純度的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞以及成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞。

關(guān)鍵詞： 少突膠質(zhì)細(xì)胞；原代培養(yǎng)；細(xì)胞增殖；EDTA

少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes， OLs）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞的[1]。少突膠質(zhì)細(xì)胞由少突膠質(zhì)前體細(xì)胞 （oligodendrocyte progenitor cells， OPCs）分化成熟而來，少突膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的損傷可致脫髓鞘疾病導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷[2]，因此研究少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷機(jī)制，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞修復(fù)是我們的目標(biāo)。所以得一種簡(jiǎn)單高效的培養(yǎng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)細(xì)胞增殖和分離純化等相應(yīng)步驟進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作步驟，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，成功獲取了大量的少突膠質(zhì)細(xì)胞，為研究少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷的其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料 清潔級(jí)出生0～3d SD乳鼠，雌雄不限，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)，實(shí)驗(yàn)過程對(duì)動(dòng)物的處置符合相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)要求，B104神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，DMEM/F12，胎牛血清，胰酶，多聚賴氨酸（PDL），小 鼠 抗 A2B5 抗體，羊抗小鼠髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）等。

2 方法

2.1 B104CM的收集和存儲(chǔ) B104細(xì)胞在20ml （DMEM/F12+10%FBS）培養(yǎng)基，75cm2的培養(yǎng)瓶 中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，棄去廢液，加入10 ml（DMEM/F12 + 1% N2 supplement） 培養(yǎng)液，4d后收集上清液備用。

2.2 少突膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及分離純化 取SD乳鼠，冰埋麻醉1～5 min，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒，無菌下取出大腦皮質(zhì)，解剖顯微鏡下剝離腦膜，取腦皮質(zhì)切成1mm2小塊，放入離心管中，加入PBS后用吸管輕輕反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液，種植于直徑10cm由PDL包被的培養(yǎng)皿內(nèi)（每只乳鼠的細(xì)胞接種于一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)）入孵箱常規(guī)培養(yǎng)5d，培養(yǎng)液為（DMEM/F12+10% FBS），隔天換液。培養(yǎng)5天后，B104CM（DMEM/F12+20%B104CM+1%N2 supplement）增殖3d后， EDTA消化機(jī)械吹打分離純化法（EDTA消化10 min，適當(dāng)力度吹打，使 OPC從星型膠質(zhì)細(xì)胞上脫落） 分離和純化 OPC。

2.3微鏡觀察 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并采圖。

2.4細(xì)胞免疫熒光染色OPC以3 ×107 /ml 的密度種植在兩個(gè)24孔板中（每孔底部放置孔徑相同的載玻片）分別培養(yǎng)1d和分化培養(yǎng)3d，PBS清洗，含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液（PBS）固定30min，山羊血清37℃封閉30min，加一抗，OPC加小鼠抗A2B5IgG （ 1：100） 標(biāo)記，分化培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞加羊抗MBP IgG （ 1：100） 標(biāo)記，4℃過夜，加抗羊IgG（ 1：500） ，濕盒內(nèi)37℃孵育30 min，PI （ 1：1000） 染核30s，50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下采集圖片。A2B5 標(biāo)記陽性的為OPC，MBP標(biāo)記陽性的為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞。

結(jié) 果

1 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況

混合培養(yǎng)5d，可見兩種形態(tài)不同的細(xì)胞。多數(shù)細(xì)胞體積較大，緊貼瓶底生長(zhǎng)，呈扁平狀有較粗大突起，胞核較大，呈圓形。位于扁平細(xì)胞的表面可見一些體積小，胞體呈圓形或橢圓形，強(qiáng)折光性強(qiáng)，具有單極或雙極的細(xì)小突起的細(xì)胞。培養(yǎng)第8d，在倒置顯微鏡下觀察，胞體扁平、突起粗大的細(xì)胞已長(zhǎng)滿瓶底，細(xì)胞完全融合，小圓形或橢圓形、強(qiáng)折光性強(qiáng)，具 有單極或雙極的細(xì)胞位于上層。純化后培養(yǎng)1d的OPC胞體成橢圓型，折光性強(qiáng)，有單極或雙極的細(xì)小突起。分化培養(yǎng)的細(xì)胞（第12 d）胞體逐漸由橢圓形變?yōu)閳A形或不規(guī)則形， 細(xì)胞突起增多，培養(yǎng)至第14 d，次極細(xì)胞突起分支增 多，常交互形成“蜘蛛網(wǎng)”樣，極為茂 密，分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞。

2 少突膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光鑒定和觀察

OPC特異性抗原A2B5陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)95%以上，綠色熒光染色信號(hào)位于細(xì)胞膜OL特異性抗原MBP陽性，細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)95%以上，綠色熒光染色信號(hào)位于胞膜； OPC胞體呈橢圓形，具有典型的雙極細(xì)小突起，綠色熒光標(biāo)記的特異性抗原A2B5位于胞體和突起上。OL胞體為圓形，細(xì)胞突起多，次極細(xì)胞突起交互成網(wǎng)樣，綠色熒光染色信號(hào)位于胞體和突起上。

原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞作為一種相對(duì)簡(jiǎn)化的模型， 生長(zhǎng)發(fā)育特征與體內(nèi)相似，且樣本純度高，實(shí)驗(yàn)條件比較恒定且可控，在闡明許多少突膠質(zhì)細(xì)胞退化所致神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞及分子機(jī)制方面有著不可替代的作用。本實(shí)驗(yàn)節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，簡(jiǎn)化培養(yǎng)步驟，獲得了大量的少突膠質(zhì)細(xì)胞，這對(duì)于以原代培養(yǎng)少突膠質(zhì)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究而言尤為重要。A2B5是少突膠質(zhì)前體細(xì)胞特異性標(biāo)記物， MBP 是成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物，本實(shí)驗(yàn)利用上述兩個(gè)蛋白與細(xì)胞核共同染色，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞性質(zhì)做鑒定及細(xì)胞純度進(jìn)行分析，證明細(xì)胞培養(yǎng)成 功，細(xì)胞純度可以達(dá)到 95%以上。

參考文獻(xiàn)

[1]龍彩瑕，李俊發(fā).中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病研究概述[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2005，25： 673-678.

[2]Tang Y，Nyengaard JR，Pakkenberg B，et al. Age-induced white matter changes in the human brain： a stereological investigation[J].Neurobiol Aging，1997，18： 609-615.