王婧

【中圖分類號】R284.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）06--01

蛭類是蛭綱科動物的總稱，俗稱螞蟥或水蛭，廣泛分布在海洋、湖泊、河流等淡水環(huán)境或者潮濕的陸地。蛭類在世界上約有400-500種，我國約有100種，已發(fā)現(xiàn)89種。雖然迄今作為醫(yī)學(xué)研究的水蛭種類較多，但是在《中國藥典》（2010年版）只收載了3種，即螞蝗（Whitmania pigra Whitman，寬體金錢蛭）、水蛭（Hirudo nipponica Whitman，日本醫(yī)蛭）或者柳葉螞蝗（Whitmania acranulata，尖細金錢蛭）。水蛭作為一味傳統(tǒng)中藥，其療效在古代《神農(nóng)百草經(jīng)》、《名醫(yī)別錄》和《本草綱目》中均有記載。水蛭性平、味咸苦、小有毒。具有“通經(jīng)、破瘀、消腫”之功效，主治血瘀經(jīng)閉，癥瘕痞塊，中風(fēng)偏癱，跌撲損傷[1]。水蛭中除了有熟知的水蛭素以外，還有多種生物活性成分，包括蛋白酶、蛋白酶抑制劑、血小板聚集抑制劑、血小板粘附抑制劑等。在臨床中廣泛用于腦血栓、冠心病、腦水腫等的治療[2]。據(jù)報道水蛭還有改善微循環(huán)、改善腦部缺氧、抗纖維化[3]及抑制腫瘤細胞[4]等作用。隨著水蛭及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，其需求量快速增長，水蛭已成為世界性的暢銷中藥材之一。水蛭種質(zhì)資源豐富，分布較廣，各品種之間的藥用效果差異顯著[5]，且這些近源物種僅依靠形態(tài)特征難以區(qū)分和鑒定，加之對于蛭類的分類系統(tǒng)未達到一致，在一定程度上影響了水蛭資源的有效利用。分子生物學(xué)鑒定手段方法為水蛭來源的鑒定提供了新的途徑。

核糖體DNA 中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ internal transcribed spacer，ITS） 序列進化速率較快，在rDNA 中，由于ITS 區(qū)不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進化速度較快，所提供的信息量也大，已被用于生物科內(nèi)、屬內(nèi)、種間以及群體間的分子系統(tǒng)演化關(guān)系研究[6]。近年來也已被用于中藥材種內(nèi)種群間的差異性研究[7]。

血栓心脈寧膠囊適用于腦血栓、冠脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛等癥。其主要成分有川芎、 丹參、 水蛭、 毛冬青、 牛黃、 麝香、槐花、 人參莖葉皂苷、 冰片、 蟾酥。功能主治：益氣活血，開竅止痛。用于氣虛血瘀所致的中風(fēng)、胸痹癥見頭暈?zāi)垦?，半身不遂，胸悶心痛，心悸氣短；缺血性中風(fēng)恢復(fù)期、冠心病心絞痛見上述證候者。

本研究通過對水蛭對照藥材、一正藥業(yè)血栓心脈寧水蛭投料藥材以及一正藥業(yè)血栓心脈寧膠囊成藥ITS序列片段的分析，鑒定及討論其水蛭來源。

1 材料

1.1 材料 血栓心脈寧膠囊（吉林一正藥業(yè)集團），水蛭投料藥材（吉林一正藥業(yè)集團），水蛭對照藥材（中檢院）

1.2 試劑 裂解緩沖液（10 mmol/L Tris-Cl （pH8.0），0.1 mol/L EDTA （pH8.0），0.5% （m/V） SDS，20μg/mg RNase）平衡酚TE（pH8.0）（100mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0））蛋白酶K（20 mg/ml）NaAc （3mol/L）EB，溴酚藍，蔗糖，DNA marker，瓊脂糖。

2 方法

核糖體DNA 中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ internal transcribed spacer，ITS） 序列進化速率較快，在rDNA 中，由于ITS 區(qū)不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進化速度較快，所提供的信息量也大，已被用于生物科內(nèi)、屬內(nèi)、種間以及群體間的分子系統(tǒng)演化關(guān)系研究[7]。近年來也已被用于中藥材種內(nèi)種群間的差異性研究[6]。

采用SDS法提取基因組DNA：稱取樣品及各對照藥材各0.5g，加入液氮研磨至細粉末狀，轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中，加入750μlDNA提取緩沖液（65℃預(yù)熱），充分混勻后，放入65℃水浴鍋中水浴60min，每10分鐘搖動一次。加入750μl飽和酚：氯仿（1：1）充分混勻，室溫12000rpm離心15分鐘，取上清。加入1/30體積的NaAc （3mol/L）和0.54倍體積的異丙醇，輕混后，置于4℃冰箱30min沉淀。室溫下12000rpm離心2min，去掉上清液，用70%乙醇洗滌沉淀兩次。適量ddH2O溶解沉淀后獲得基因組。

通過primer5軟件設(shè)計ITS基因引物，ITS-F：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3；ITS-R：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。合成引物用于PCR（奧科生物公司合成）。ITS-PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，反應(yīng)體系組成：10×Buffer （ Mg2+ ） 2.5μL，dNTPs Mixture （ 2.5 mmol /L） 2.0 μL，引物（ 10μmol /L） 各0.5 μL，Taq 酶（ 5 U/μL） 0.2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 補至25 μL。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色，全自動凝膠成像系統(tǒng)拍照。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，測序（奧科生物公司）。

3 結(jié)果與討論

3.1 PCR電泳結(jié)果

對水蛭對照藥材（中檢院），水蛭投料藥材（吉林一正藥業(yè)集團），血栓心脈寧膠囊（吉林一正藥業(yè)集團）三個樣本提取基因組，PCR結(jié)果如圖1所示：

3.2 PCR產(chǎn)物回收測序比對結(jié)果

3.2.1 序列特征及堿基組成 經(jīng)過PCR擴增，得到三個樣本的ITS基因片段，他們的ITS序列長度分別為：水蛭對照藥材（中檢院）972bp，水蛭投料藥材（吉林一正藥業(yè)集團）972bp，血栓心脈寧膠囊（吉林一正藥業(yè)集團）974bp。

3.2.2 序列分析及blast比對 將水蛭對照藥材（中檢院），水蛭投料藥材（吉林一正藥業(yè)集團），血栓心脈寧膠囊（吉林一正藥業(yè)集團）經(jīng)PCR擴增的到的ITS序列測序后比對NCBI數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)他們與JX885691序列（寬體金線蛭Whitmania pigra Whitman）Blast得分最高，如圖2顯示序列比較，圖3顯示進化樹圖。經(jīng)過分析認為水蛭投料藥材（吉林一正藥業(yè)集團），血栓心脈寧膠囊（吉林一正藥業(yè)集團）兩個樣品水蛭來源與JX885691序列（寬體金線蛭Whitmania pigra Whitman）一致。

討論

研究ITS序列，為水蛭資源保護和物種資源庫建立提供依據(jù)，優(yōu)先保護群體內(nèi)遺傳多樣性豐富的種群?？梢酝ㄟ^調(diào)查和整理，發(fā)現(xiàn)并評價選育出優(yōu)良品質(zhì)和相對穩(wěn)定的中藥材品種。PCR技術(shù)在分析可以進一步對水蛭質(zhì)量進行評價，包括螞蟥真?zhèn)蔚蔫b別，以及螞蟥來源鑒別，主要經(jīng)濟性狀比較，安全性評價特別是藥理評價等方面。

參考文獻

中國藥典2015年版.一部

黃榮清，駱傳環(huán)，彭江南，等.水蛭中小分子活性成分的GC-MS 研究[J].中草藥，2003，34（9）： 788-789.

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任青華，牟忠祥，耿延君，等.中藥水蛭素對荷瘤鼠Ki-67 與VEGF 表達的影響[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2010，39（6）： 46-48.

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