（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510640；2.廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣州510640）

0 引言

隨著研究人員對(duì)乳酸菌的不斷研究，乳酸菌類產(chǎn)品的應(yīng)用越來越廣泛[1]。植物乳桿菌作為白菜、甘藍(lán)、黃瓜等蔬菜發(fā)酵的主要微生物之一[2]，具有降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂、控制體質(zhì)量等益生保健功效[3]。目前，乳酸菌制劑采用真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等不同的方法進(jìn)行制備[4-8]，其中冷凍干燥是生產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵劑常使用的工藝，但是凍干過程中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力降低。陳濤等[9]研究發(fā)現(xiàn)在凍干過程中影響菌粉存活率的因素有很多，研究如何提高存活率具有重要意義[10-11]。

筆者課題組前期從泡菜水中篩選出得到具有較好的降膽固醇效果的植物乳桿菌DMDL9010(Lactobacillus plantarum DMDL9010)，對(duì)其離心條件和凍干保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化，以期為提高菌粉凍干存活率及開發(fā)商品化蔬菜發(fā)酵專用乳酸菌劑提供理論基礎(chǔ)。

1.1 菌種、培養(yǎng)基和保護(hù)劑

植物乳桿菌 DMDL9010（Lactobacillus plantarum DMDL9010），由華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全系篩選分離并保存。

MRS培養(yǎng)基，在 0.10-0.15 MPa，121℃滅菌 15 min；脫脂乳粉、葡萄糖、海藻糖、甘氨酸、可溶性淀粉、抗壞血酸、硫酸錳均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-18N），高速離心機(jī)（JW-3021HR），立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-18SI）。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將植物乳桿菌DMDL9010按照體積分?jǐn)?shù)為3%的接種量，接種至基礎(chǔ)MRS培養(yǎng)基中，活化菌株。

1.4.2 離心條件的優(yōu)化

在離心轉(zhuǎn)速分別為4 000，6 000，8 000，10 000 r/min、的條件下，將活化好的菌懸液，分別進(jìn)行10，20，30 min

1 實(shí) 驗(yàn)

離心，收集上清液與菌泥，稀釋平板計(jì)數(shù)[12]，比較在不同參數(shù)下菌株的離心存活率[13]。

1.4.3 單一保護(hù)劑的篩選

選取脫脂乳粉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同，3%，6%，9%，12%，15%），葡萄糖（2%，4%，6%，8%，10%），細(xì)菌學(xué)蛋白胨（2%，4%，6%，8%，10%），可溶性淀粉（10%，12%，14%，16%，18%，20%），甘氨酸（3%，6%，9%，12%），甘油（1.0%，1.2%，1.4%，1.6%，1.8%，2.0%），海藻糖（10%，12%，14%，16%，18%）作為單一凍干保護(hù)劑，以單體菌粉活菌數(shù)（g-1）[14]為依據(jù)，研究其在凍干過程中對(duì)植物乳桿菌DMDL9010的保護(hù)效果。其中，菌泥與配制的凍干保護(hù)劑溶液體積為1∶3。

1.4.4 Box-Behnken 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將單因素篩選出的保護(hù)效果較好的凍干保護(hù)劑脫脂乳粉、海藻糖和細(xì)菌學(xué)蛋白胨做為實(shí)驗(yàn)因素，以植物乳桿菌粉活菌數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。采用Design Expert 8.0.5軟件輔助實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。并重復(fù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)保護(hù)劑組合，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平 %

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Design Expert 8.0軟件完成響應(yīng)面設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、回歸模型建立，Origin Pro 8.0進(jìn)行作圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每組實(shí)驗(yàn)測(cè)定3個(gè)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用M±SD表示。

2 結(jié)果分析

2.1 離心條件的優(yōu)化分析

表2 離心實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，相同離心時(shí)間下，隨轉(zhuǎn)速的升高，上清液活菌數(shù)顯著降低，菌泥活菌數(shù)先升高后降低，且在轉(zhuǎn)速為8 000 r/min時(shí)達(dá)到最大活菌數(shù)，這表明過低的離心轉(zhuǎn)速使得菌體無法充分沉淀，獲得菌泥量少，而過高的離心轉(zhuǎn)速雖能有效使菌體沉淀，但對(duì)活菌機(jī)械損傷程度大，大量活菌在離心過程中受到損傷、死亡。相同轉(zhuǎn)速下，隨離心時(shí)間的延長(zhǎng)，上清液活菌數(shù)明顯降低，菌泥活菌數(shù)明顯增加，且在離心30 min時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大，表明足夠的離心時(shí)間可以使活菌充分沉淀。但離心時(shí)間不宜過長(zhǎng)，過長(zhǎng)的離心時(shí)間會(huì)使效率降低，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。這與王大欣[15]等的研究結(jié)果一致，在保證較高的活菌數(shù)量的前提前選擇最優(yōu)的離心條件。

選取8 000 r/min（30 min）的離心參數(shù)，以保證最佳的離心存活率，此時(shí)菌泥活菌數(shù)可達(dá)最大值31.35×108mL-1。

2.2 單一凍干保護(hù)劑篩選

表3 不同凍干保護(hù)劑對(duì)植物乳桿菌DMDL9010的影響 g-1

由表3可知，當(dāng)菌泥中加入6.0%的脫脂乳粉時(shí)，凍干后菌株存活率可達(dá)43.16%，與楊加懷[16]的研究結(jié)果一致，脫脂乳粉對(duì)植物乳桿菌DMDL9010具有顯著的保護(hù)作用。脫脂乳粉是良好的有機(jī)氮源、碳源，且脫脂乳粉中含有的乳清蛋白在冷凍干燥的過程中對(duì)植物乳桿菌DMDL9010有一定的保護(hù)作用[17-18]。

當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于8.0%時(shí)，隨著葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，凍干后菌株存活率明顯提高，高于8.0%時(shí)，存活率顯著降低，即當(dāng)菌泥中加入8.0%葡萄糖時(shí)，凍干后菌株存活率可達(dá)到最大16.14%。葡萄糖可以促進(jìn)細(xì)胞在懸浮液中分散，還可以作為細(xì)胞今后生長(zhǎng)用的碳源[19]。但與其他的備選保護(hù)劑相比，葡萄糖對(duì)植物乳桿菌DMDL9010的保護(hù)作用要低于脫脂乳粉、海藻糖和細(xì)菌學(xué)蛋白胨，這與張英華等[17]的研究一致。

細(xì)菌學(xué)蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.0%時(shí)，菌株存活率最高30.24%，但細(xì)菌學(xué)蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于或高于8.0%時(shí)，存活率顯著降低，且保護(hù)劑含量增高易出現(xiàn)凍干不徹底現(xiàn)象，影響凍干菌粉的品質(zhì)。

在一定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，隨著可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，凍干后菌株存活率提高。但可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于16.0%時(shí)，存活率呈明顯下降的趨勢(shì)，即當(dāng)菌泥中加入16.0%的可溶性淀粉時(shí)，存活率最高僅為4.75%。這與張澤生等[18]的研究一致，加入可溶性淀粉后，植物乳桿菌的存活率較低。

甘氨酸對(duì)于植物乳桿菌DMDL9010的保護(hù)作用比較有限。隨著甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，凍干后菌株存活率顯著降低。甘氨酸的在生理鹽水中的溶解度較低，且與其他備選保護(hù)劑相比，所凍干后活菌數(shù)較低，獲得甘氨酸的成本較高，工業(yè)上的應(yīng)用可行性不足，因此，不宜選擇甘氨酸作為后續(xù)優(yōu)化的凍干保護(hù)劑。

甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%時(shí)，凍干后菌株存活率最高3.64%。甘油屬低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的黏度增加，從而弱化了水的結(jié)晶過程，減輕了細(xì)胞外溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高所造成的細(xì)胞損傷。同時(shí)，甘油進(jìn)入細(xì)胞后，使細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，細(xì)胞內(nèi)壓力接近于細(xì)胞外壓力，減少了細(xì)胞脫水的程度和速度[20]。當(dāng)甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.0%以上時(shí)不易凍干，所制成的菌粉較黏稠，無法研磨成粉末狀。

海藻糖具有抗凍抗熱的穩(wěn)定性。海藻糖不僅可以通過與細(xì)胞外水分子形成氫鍵來提高細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[21]，而且它具有較高的晶體轉(zhuǎn)換溫度，可以在較高的凍干溫度下保持很好的穩(wěn)定性[22]。，當(dāng)菌泥中加入14.0%海藻糖時(shí)，凍干后菌株存活率最高，達(dá)28.68%。這與王大欣[15]等的研究結(jié)果相一致，在眾多的保護(hù)劑中，海藻糖保護(hù)效果顯著。

綜上所述，添加脫脂乳粉6.0%，細(xì)菌學(xué)蛋白胨8.0%，海藻糖14.0%時(shí)菌株存活率最高，對(duì)植物乳桿菌DMDL9010凍干的保護(hù)效果較好。這與張英華等[17]的研究一致，張英華等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脫脂乳粉、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、海藻糖對(duì)乳酸菌的保護(hù)作用要優(yōu)于其他凍干保護(hù)劑。

2.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以植物乳桿菌粉活菌數(shù)為單一指標(biāo)，選擇脫脂乳粉、海藻糖和細(xì)菌學(xué)蛋白胨作為3個(gè)實(shí)驗(yàn)因素做Box-Behnken設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用DesignExpert8.0軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得回歸模型方差分析，結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken回歸模型的方差分析結(jié)果

對(duì)表5回歸模型方差分析，實(shí)驗(yàn)所選用模型P值0.0002＜0.05，決定系數(shù)R2=0.9696，說明模型與實(shí)際情況擬合良好。根據(jù)以上分析得知活菌數(shù)Y對(duì)自變量脫脂乳粉（A）、細(xì)菌學(xué)蛋白胨（B）、海藻糖（C）的多元回歸方程：

該方程表達(dá)了植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)和3個(gè)自變量之間的線性關(guān)系是顯著的，同時(shí)實(shí)驗(yàn)方法也是可靠的?；貧w方程的一次項(xiàng)系數(shù)比較大，交互項(xiàng)系數(shù)中BC的交互系數(shù)比較大，說明細(xì)菌學(xué)蛋白胨和海藻糖之間的交互效應(yīng)大，而AB、AC的交互系數(shù)比較小，說明脫脂乳粉和細(xì)菌學(xué)蛋白胨、脫脂乳粉和海藻糖之間的交互效應(yīng)小。

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)測(cè)定的植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，并對(duì)各因子的偏回歸系數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。一次項(xiàng)中A的回歸系數(shù)高度顯著，P＜0.0001說明脫脂乳粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)植物乳桿菌DMDL9010生長(zhǎng)有高度顯著作用。C的回歸系數(shù)僅次于A，說明不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)植物乳桿菌DMDL9010生長(zhǎng)影響僅次于脫脂乳粉。交互項(xiàng)BC回歸系數(shù)較其他因素顯著，說明細(xì)菌學(xué)蛋白胨和海藻糖之間的交互項(xiàng)對(duì)植物乳桿菌DMDL9010的生長(zhǎng)較為顯著。擬合度R2=0.9696，說明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合度良好。

根據(jù)回歸方程作出不同因子的響應(yīng)面分析圖及等高線圖（圖1），分析脫脂乳粉（A）、細(xì)菌學(xué)蛋白胨（B）、海藻糖（C）的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)組合對(duì)凍干后植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)的影響。

圖1 Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)擬合響應(yīng)曲面交互作用影響

為了得到植物乳桿菌DMDL9010菌粉最大活菌數(shù)，培養(yǎng)基中脫脂乳粉和海藻糖水平需要比例適宜。由圖1和方差分析可知，對(duì)植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)的影響順序?yàn)锽C＞AB＞AC。

對(duì)二次回歸方程求一階偏導(dǎo)，當(dāng)響應(yīng)值Y（凍干菌粉活菌數(shù)）最大值時(shí)各因子水平為脫脂乳粉（A）12.00%、細(xì)菌學(xué)蛋白胨（B）7.95%、海藻糖（C）15.20%。此時(shí)理論預(yù)測(cè)植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)為4.195×108g-1，其中凍干存活率達(dá)13.38%。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，重復(fù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)凍干保護(hù)劑組合（脫脂乳粉12.00%，細(xì)菌學(xué)蛋白胨7.95%，海藻糖15.20%）。結(jié)果表明，植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)可達(dá)3.78×108g-1，與理論預(yù)測(cè)值相吻合。

3 結(jié) 論

本文探究了植物乳桿菌DMDL9010凍干優(yōu)化的方法，應(yīng)用離心法收集菌泥，探究不同離心速率及時(shí)間對(duì)菌體活菌率的影響，最終確定了最佳離心條件為8 000r/min（30 min），此時(shí)菌泥活菌數(shù)可達(dá)最大值3.135×108mL-1，但離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間參數(shù)過大，有待于進(jìn)一步探討；通過單因素篩選和響應(yīng)面優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到的二次響應(yīng)曲面模型具有較高的回歸率，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合程度較高，確定了脫脂乳粉12.0%，細(xì)菌學(xué)蛋白胨7.95%，海藻糖15.2%時(shí)為最佳保護(hù)劑配方，此時(shí)理論預(yù)測(cè)植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)為 4.195×108g-1，進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得實(shí)際菌體數(shù)為3.78×108g-1，即凍干后菌體活力高，凍干存活率達(dá)13.38%，為開發(fā)商品化蔬菜發(fā)酵專用乳酸菌劑提供理論基礎(chǔ)。此凍干保護(hù)劑配方成分簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，可為其他微生物或動(dòng)植物細(xì)胞保護(hù)提供參考。