張磊，王利剛，付莎莉，吳丹，陳欣，蘇敏，黃思瑜，楊小珊

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶401121）

0 引言

在奶牛飼養(yǎng)中使用β-內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素可導(dǎo)致生產(chǎn)的生鮮牛乳中含有抗生素殘留，國際和國內(nèi)均規(guī)定生鮮乳中抗生素“不得檢出”[1]。2009年，全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治領(lǐng)導(dǎo)小組發(fā)布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單(第二批)》，將β-內(nèi)酰胺酶（金玉蘭酶制劑）列入乳與乳制品中可能違法添加的非食用物質(zhì)，生鮮牛乳中添加β-內(nèi)酰胺酶的現(xiàn)象得以改善[2]，但仍有生鮮乳中檢出β-內(nèi)酰胺酶的報(bào)道[3-8]。

目前，檢驗(yàn)中用到的β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法有碘量法[9]、酸度法[10]、高效液相色譜法[11]、免疫法[12]、微生物法（杯碟法）等[13]。本研究將杯碟法、碘量法和基于免疫法的快速檢測(cè)條法三種實(shí)驗(yàn)室常用檢驗(yàn)方法進(jìn)行了比較和討論，為實(shí)驗(yàn)室β-內(nèi)酰胺酶的檢驗(yàn)工作提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

恒溫培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，牛津杯，麥?zhǔn)媳葷醿x，Charm ROSA 56C孵育器，Charm ROSA讀數(shù)儀。

藤黃微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，營養(yǎng)瓊脂，抗生素檢測(cè)用培養(yǎng)基Ⅱ，Charm MRLβ-內(nèi)酰胺酶快速檢測(cè)條，濃度為0.1 mol/L碘標(biāo)液，脫脂奶粉。

青霉素標(biāo)準(zhǔn)品，β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品，舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 試劑配制

磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.0）：無水KH2PO4為8.0 g，無水K2HPO4為2.0 g，蒸餾水加至1 000 mL，121℃滅菌15 min。

青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取適量青霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液：量取β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取適量舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?，不可反?fù)凍融使用。

脫脂牛奶：稱取適量脫脂奶粉，用蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的脫脂牛奶。

1%淀粉指示液：取可溶性淀粉1 g，加水5 mL攪勻后，調(diào)成糊狀，再加蒸餾水80 mL，加熱，使其溶解，最后用蒸餾水稀釋至100 mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 方法

1.3.1 杯碟法

按照《關(guān)于印發(fā)全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治抽檢工作指導(dǎo)原則和方案的通知(食品整治辦[2009]29號(hào))》附件3中指定檢驗(yàn)方法《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)方法-杯碟法》進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.3.2 碘量法

取1 mL脫脂牛奶于試管中，依次加入1 mL100、80、60、50、40、30、20 U/mLβ-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，在37℃水浴中恒溫振蕩40 min，加入1%淀粉溶液50μL，再加入濃度為0.1 mol/L碘標(biāo)液20μL，不斷振蕩，于2 min內(nèi)觀察顏色變化情況。

1.3.3 快速檢測(cè)法

取出一片陽性質(zhì)控藥片到質(zhì)控物配制管中，再加入1 mL的蒸餾水或陰性牛奶，充分混勻配成陽性質(zhì)控溶液。調(diào)節(jié)孵育器溫度至56℃。取陽性質(zhì)控溶液50μL到離心管中，再加入375μL待檢測(cè)樣品充分混勻，靜置40 min，配成待檢溶液。取出檢測(cè)條，水平放置在孵育器上，小心揭開黏膜至指示線處。用移液器取300μL已配好的待檢溶液，緩慢豎直滴加至檢測(cè)條的凹槽中。將貼膜重新封好，蓋上孵育器塑料蓋，自動(dòng)開始倒計(jì)時(shí)。孵育8分鐘結(jié)束后，蜂鳴器響動(dòng)，取出檢測(cè)條，3 min內(nèi)判讀結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 杯碟法

根據(jù)《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)方法-杯碟法》中結(jié)果報(bào)告部分進(jìn)行判定，判定前應(yīng)首先確定純水的抑菌系統(tǒng)成立，然后根據(jù)系統(tǒng)不同添加物的抑制圈的大小差異進(jìn)行判定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 杯碟法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

該方法采用的標(biāo)準(zhǔn)菌株藤黃微球菌對(duì)青霉素類藥物絕對(duì)敏感，舒巴坦可特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，青霉素作為底物，通過比對(duì)樣品添加與不添加β-內(nèi)酰胺酶抑制劑（舒巴坦）所產(chǎn)生的抑制圈的大小來間接測(cè)定樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶濃度在4 U/mL時(shí)，能夠判定檢出，故該方法的檢出限為4 U/mL，與方法限定相符。

杯碟法的實(shí)驗(yàn)操作較為繁瑣，包括以下多個(gè)步驟，菌懸液制備、樣品制備、檢驗(yàn)平板制備、放置牛津杯、檢樣分組處理、加樣培養(yǎng)、測(cè)量抑菌圈等，要求操作者具有較高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和豐富的經(jīng)驗(yàn)。該方法的檢出限靈敏，為β-內(nèi)酰胺酶檢驗(yàn)的制定方法，故針對(duì)其實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化的研究較多，為該方法的實(shí)施積累了經(jīng)驗(yàn)[14-15]

，有研究給出了青霉素G和舒巴坦的最佳使用質(zhì)量濃度，并指出不同廠家的β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)限不同，以此為基礎(chǔ)對(duì)杯碟法進(jìn)行了優(yōu)化[16]。有研究針對(duì)指示菌的濃度和培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響提出了優(yōu)化方案[17]。

2.2 碘量法

添加淀粉溶液和碘標(biāo)液后，在2 min內(nèi)能進(jìn)行判定。2 min內(nèi)使藍(lán)色完全消退的為陽性，不消退者為陰性，即白色表示含有β-內(nèi)酰胺酶，藍(lán)色為不含β-內(nèi)酰胺酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 碘量法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

β-內(nèi)酰胺酶的親核基團(tuán)可將青霉素開環(huán)形成青霉酸，隨后脫羧重排生成青霉噻唑酸(benzylpenicilloic acid，BPA)，青霉噻唑酸可與淀粉競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合游離碘，從而破壞碘與淀粉生成的藍(lán)色復(fù)合物，使藍(lán)色變?yōu)闊o色。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶濃度在25 U/mL時(shí)，出現(xiàn)部分褪色的情況，說明此條件下β-內(nèi)酰胺酶催化青霉素的產(chǎn)物不足以完全結(jié)合碘，不能定性；當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶濃度在30 U/mL時(shí)，可在2 min時(shí)間內(nèi)完全褪色，滿足定性判斷要求，因此，認(rèn)定該方法的檢測(cè)限為30 U/mL。

該方法的操作簡(jiǎn)單但是也存在較多制約因素：（1）實(shí)驗(yàn)要求2 min內(nèi)進(jìn)行判讀，原因分析如下：第一，碘和淀粉形成的碘-淀粉包合物不穩(wěn)定，容易分解出現(xiàn)褪色；第二、淀粉分子末端的醛基會(huì)被碘氧化，也會(huì)造成褪色。（2）牛乳中含有的脂肪也會(huì)與碘發(fā)生反應(yīng)，可通過離心或者甲醇提取等方法去除牛乳中的脂肪。（3）牛乳本身為乳白色不利于褪色反應(yīng)的觀察，因此除整組實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照外，每組檢樣可設(shè)置陰性對(duì)照，以便對(duì)比觀察反應(yīng)結(jié)果。

2.3 快速檢測(cè)法

孵育器中取出后3 min內(nèi)進(jìn)行判定，如果檢測(cè)線的顏色和控制線的顏色一致或者比控制線顏色深，則判斷樣品為陽性。如果檢測(cè)線的顏色不可見或者比控制線顏色淺時(shí)，則判斷樣品為陰性。也可使用讀數(shù)儀進(jìn)行判定，當(dāng)讀數(shù)儀讀數(shù)結(jié)果為小于等于+500時(shí)可以判定為β-內(nèi)酰胺酶陽性，當(dāng)大于+500時(shí)判定為β-內(nèi)酰胺酶陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

該方法為一種免疫分析方法，基于極低濃度的β-內(nèi)酰胺酶便可催化水解一定濃度的青霉素G，然后通過配體-受體識(shí)別法快速檢測(cè)與反應(yīng)后殘留的青霉素的含量，間接檢測(cè)樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶濃度在4 U/mL時(shí)，肉眼無法判讀，但讀數(shù)儀讀數(shù)結(jié)果均高于500，判定檢出。因此，認(rèn)定該方法的檢測(cè)限為4 U/mL。

表3 快速檢測(cè)條靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

該方法檢驗(yàn)過程包括以下3個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：（1）將質(zhì)控物和待檢測(cè)牛奶樣品混合；（2）β-內(nèi)酰胺酶和質(zhì)控物青霉素G快速反應(yīng)；（3）在56℃孵育8 min過程中，在測(cè)試條的檢測(cè)線（T線）處可以檢測(cè)到剩余的青霉素。如牛奶樣品中有β-內(nèi)酰胺酶，測(cè)試條的檢測(cè)線（T線）區(qū)會(huì)出現(xiàn)紅色條帶，而控制線（C線）區(qū)會(huì)出現(xiàn)淺紅色的條帶。如牛奶樣品中沒有摻雜β-內(nèi)酰胺酶，或者β-內(nèi)酰胺酶的量少于可檢測(cè)到的范圍，在測(cè)試條上控制線（C線）區(qū)有出現(xiàn)紅色條帶，檢測(cè)線（T線）區(qū)會(huì)出現(xiàn)淺紅色的條帶。此外，在檢驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)檢樣中乳脂或蛋白含量很高，導(dǎo)致檢測(cè)條的質(zhì)控線（C線）不現(xiàn)色，可離心后除去脂肪、蛋白層后進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)論

綜合3種方法的檢驗(yàn)原理、所需設(shè)備等方面進(jìn)行比較，簡(jiǎn)要的比較情況如表4所示。

表4 3種方法的綜合比較

由表4可以看出，杯碟法作為國家推薦方法，在靈敏度上具有很好的優(yōu)勢(shì)，但是該方法實(shí)際操作中需要大量的準(zhǔn)備工作，操作過程繁瑣，從準(zhǔn)備試驗(yàn)到判定結(jié)果，需要2～3 d才能完成，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的經(jīng)驗(yàn)和操作能力有著極強(qiáng)的要求。碘量法相對(duì)快速，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)成本較低，但是其靈敏度難以達(dá)到要求?？焖贆z測(cè)法操作簡(jiǎn)單，速度快，且靈敏度高，但其成本相對(duì)較高。因此，在實(shí)驗(yàn)條件相對(duì)落后的奶站等從業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行自檢時(shí)，建議采用碘量法這種成本較低的檢驗(yàn)方法作為初篩方式，對(duì)于陽性樣品可以直接拒收，對(duì)于未出現(xiàn)陽性反應(yīng)的樣品也應(yīng)送有資質(zhì)的相關(guān)食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢驗(yàn)，確保乳品質(zhì)量；在相關(guān)食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)按照《乳與乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢測(cè)方法—杯碟法》進(jìn)行檢驗(yàn)，且應(yīng)做好方法確認(rèn)，在實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況進(jìn)行優(yōu)化，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，如有應(yīng)急檢驗(yàn)可采用杯碟法和快速檢測(cè)法一同開展檢驗(yàn)，快速檢測(cè)法獲得初步結(jié)論，杯碟法進(jìn)行驗(yàn)證；在大型乳品企業(yè)可采用快速檢測(cè)條，在保證檢驗(yàn)靈敏度的同時(shí)，盡可能縮短檢驗(yàn)時(shí)間，保證生鮮乳盡快的投入乳品生產(chǎn)，使人們能享受到更新鮮、更安全的乳品。