黃 明 孫瑩杰 張鐵錚 李 凱 鄭昊龍 何寶文 陳克研

(1.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科， 沈陽(yáng) 110016)(2.沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院麻醉科，沈陽(yáng) 110031)

椎間盤突出癥是骨科常見(jiàn)的疾病，尤以腰椎更為常見(jiàn)，雖然目前準(zhǔn)確的病因尚未明確，但椎間盤的退變是這一過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為深入探討椎間盤退變的病因及病理生理機(jī)制，建立巴馬豬腰椎間盤退變模型具有一定的必要性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立退變的巴馬豬椎間盤退變模型，產(chǎn)生與臨床相似病變癥狀，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體內(nèi)模擬并觀察椎間盤退變過(guò)程，生化物質(zhì)的檢驗(yàn)分析及其他伴隨癥狀，從而為臨床椎間盤退變性疾病的研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康成年巴馬豬6頭(由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供)雌雄不限，體質(zhì)量50～60 kg，按數(shù)字表法隨機(jī)分為2組，每組3頭，分別為空白對(duì)照組(Con組)和造模組(Mod組)，在標(biāo)準(zhǔn)的飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)2周。2組巴馬豬的一般情況見(jiàn)表1。

表1 2組巴馬小型豬實(shí)驗(yàn)前一般情況Table 1 The general situation of two groupsof Bama miniature pigs

1.2 動(dòng)物模型建立

1.2.1麻醉與監(jiān)測(cè):巴馬小型豬，術(shù)前禁食12 h，不禁水。術(shù)前取耳緣靜脈穿刺建立靜脈通路。靜注丙泊酚3.0 mg/kg體質(zhì)量；待呼吸減慢，肢體活動(dòng)消失，角膜反射消失時(shí)，行氣管內(nèi)插管。麻醉成功后，將巴馬小型豬固定在手術(shù)臺(tái)上，持續(xù)泵入丙泊酚8 mL/h維持麻醉，術(shù)中監(jiān)測(cè)生命體征，調(diào)整給藥劑量。

1.2.2手術(shù)步驟:將豬麻醉成功后，進(jìn)行生命體征監(jiān)測(cè)，開(kāi)通靜脈通路，靜點(diǎn)生理鹽水，在生理鹽水中加160萬(wàn)U青霉素預(yù)防感染，并對(duì)豬背部進(jìn)行備皮，對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行常規(guī)消毒，鋪無(wú)菌洞巾，術(shù)中根據(jù)情況調(diào)整丙泊酚劑量。在具有影像引導(dǎo)(C形臂X光引導(dǎo))手術(shù)室內(nèi)，將豬以左側(cè)臥位躺在射線手術(shù)臺(tái)上。

1.2.3椎間盤退變手術(shù)過(guò)程:在C形臂X光引導(dǎo)下確定豬L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎間隙，用1%的利多卡因進(jìn)行浸潤(rùn)麻醉，用16G的引導(dǎo)針沿定位點(diǎn)穿刺椎間盤。穿透纖維環(huán)后側(cè)后，呈放散狀將椎間盤進(jìn)行針刺破壞。每個(gè)間盤進(jìn)行6次穿刺，每個(gè)角度間隔30度，將椎間盤進(jìn)行破壞，完成造模見(jiàn)圖1。術(shù)后將穿刺點(diǎn)外敷無(wú)菌敷料，并用膠布固定，繼續(xù)應(yīng)用青霉素80萬(wàn)U，連續(xù)應(yīng)用3 d，每日觀察大小便以及飲食情況，1周后去除敷料，術(shù)后1個(gè)月行MR檢測(cè)驗(yàn)證模型是否成功。

圖1 C形臂X光引導(dǎo)下進(jìn)行椎間盤手術(shù)Fig.1 The C-arm X-ray guided the intervertebral disc operation

1.3 影像學(xué)檢查

在豬進(jìn)行造模前、造模后1個(gè)月分別進(jìn)行MR檢測(cè)，觀察椎間盤狀態(tài)，每次行MR檢查均將豬進(jìn)行全麻，并監(jiān)測(cè)生命體征。進(jìn)行MR后密切觀察豬的飲食及二便3 d，一切均正常后，進(jìn)行統(tǒng)一飼養(yǎng)。并運(yùn)用Pfirrmann分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估[1]。

1.4 椎間盤HE染色觀察病理改變

放血處死，游離豬的脊柱，找出相對(duì)應(yīng)的椎間盤，切開(kāi)椎間盤周圍的韌帶及組織，進(jìn)行鈍性分離，用手術(shù)刀將椎間盤切開(kāi)，使上下兩個(gè)椎體分開(kāi)，并取下纖維環(huán)，放入4%甲醛溶液中固定，對(duì)椎間盤組織進(jìn)行HE染色。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)(MRI)變化

Videman等[2]根據(jù)椎間盤含水量的變化將退變分為4級(jí):I級(jí),無(wú)明顯退變征象,表現(xiàn)為T2加權(quán)像均勻高信號(hào)；Ⅱ級(jí),可見(jiàn)輕度退變征象,T2加權(quán)信號(hào)強(qiáng)度輕度降低；Ⅲ級(jí)，中度退變,信號(hào)強(qiáng)度中度降低,且不均勻；Ⅳ級(jí),嚴(yán)重退變,信號(hào)缺失。

圖2 巴馬豬腰椎間盤MR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 MRI results of intervertebral discs of Bama miniature pigs

MR檢測(cè)結(jié)果顯示：Con組巴馬豬椎間盤纖維環(huán)呈中等信號(hào),髓核呈高信號(hào)影,纖維環(huán)信號(hào)略有不均勻,局部呈低信號(hào)影；Mod組巴馬豬椎間隙變窄，椎間盤后突，硬膜囊受壓，髓核信號(hào)基本喪失，椎間盤變型，由于造模過(guò)程中對(duì)組織損傷較大，部分椎體高度發(fā)生明顯變化(圖2)。

Pfirrmann分級(jí)顯示， Con組中的MR影像主要以Ⅰ～Ⅱ級(jí)為主，未見(jiàn)明顯的退變征象；Mod組中主要以Ⅲ～Ⅳ級(jí)為主，可見(jiàn)明顯的退行性改變，其中 Con組椎間盤的Ⅰ、Ⅱ級(jí)總數(shù)為100%，而Mod組Ⅰ、Ⅱ級(jí)總數(shù)為16.7%。

2.2 椎間盤形態(tài)學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示，Con組椎間盤未見(jiàn)明顯退變痕跡，髓核呈白色膠凍狀、含水豐富，清晰飽滿，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)清楚、呈同心圓排列，排列整齊，按Thompson分級(jí)為I級(jí)；而Mod組的椎間盤纖維化結(jié)構(gòu)紊亂，纖維環(huán)局部明顯可見(jiàn)中斷,形成一個(gè)瘢痕樣針刺通道,貫穿整個(gè)纖維環(huán)及髓核,通道周圍組織廣泛硬化,并有骨贅形成， Thompson分級(jí)為Ⅳ～Ⅴ級(jí)，見(jiàn)圖3～4，表3。

圖3 2組巴馬豬間盤大體病理改變Fig.3 Gross pathological changes of plate among the two groups

圖4 2組巴馬小型豬椎間盤病理組織學(xué)變化 HE染色 ×100Fig.4 Histopathological changes of intervertebral discs in two groups of Bama miniature pigs by HE staining ×100

表3 2組豬椎間盤病理分級(jí)表Table 3 Pathological grading table of two groups ofporcine intervertebral disc

3 討論

椎間盤退變的動(dòng)物模型的制作己有近百年的歷史。不同學(xué)者對(duì)椎間盤退變動(dòng)物選擇不盡相同，至今已有鼠、犬、兔、羊、猴、豬等十余種動(dòng)物成功建立了椎間盤退變模型[3]。根據(jù)退變的原因，模型的建立主要包括誘發(fā)性和自發(fā)性兩種[4-5]。誘發(fā)性模型既通過(guò)改變椎間盤生物力學(xué)結(jié)構(gòu)、破壞椎間盤結(jié)構(gòu)及進(jìn)行基因敲除造成退變。自發(fā)性模型是通過(guò)特殊的飼養(yǎng)方法或者改變遺傳性狀造成的動(dòng)物椎間盤退行性改變。在建立動(dòng)物椎間盤退變模型中，多采用誘發(fā)性模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，自發(fā)性退變模型因受退變機(jī)制不明確、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)中很少應(yīng)用。誘發(fā)性椎間盤退變模型有手術(shù)直接損傷和化學(xué)損傷兩種方式[6]?；瘜W(xué)損傷方式相比于直接破壞來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定性較差，藥物劑量難以把握，所以目前基本以直接損傷為主。直接破壞椎間盤有3種方式：終板破壞、髓核抽吸和纖維環(huán)穿刺法。纖維環(huán)穿刺法誘發(fā)的退變相對(duì)較輕，退變的程度與穿刺損傷的程度呈正相關(guān),適合于早期退變研究；終板破壞和髓核抽吸型退變模型造成椎間盤的破壞較重，誘發(fā)的退變出現(xiàn)時(shí)間較短,進(jìn)展較快,比較適合于對(duì)中晚期退變的研究[7]。本研究實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)較長(zhǎng)，研究手段是低強(qiáng)度激光進(jìn)行治療，研究對(duì)象的椎間盤病變相對(duì)較輕，結(jié)構(gòu)未發(fā)生特別重大改變，所以選擇的造模方式為針刺法。

在動(dòng)物模型的物種選擇上,最佳的動(dòng)物對(duì)象應(yīng)屬靈長(zhǎng)類及大型家畜，因?yàn)樯鲜鰟?dòng)物的解剖結(jié)構(gòu)與人類最為接近,但由于實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和倫理等條件約束,無(wú)法得到廣泛應(yīng)用。目前應(yīng)用較多的模型是大鼠和兔子，但大鼠與兔子的椎間盤相對(duì)較小，椎間盤的力學(xué)結(jié)構(gòu)與人類的相差較遠(yuǎn)，無(wú)法完全滿足椎間盤的一些處置。豬的解剖結(jié)構(gòu)與人類解剖相似，相比于大鼠、兔子等小型動(dòng)物，豬的椎間盤較大，解剖結(jié)構(gòu)差異小，容易進(jìn)行較復(fù)雜的操作，是較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。國(guó)內(nèi)學(xué)者已應(yīng)用豬進(jìn)行椎間盤退行性變的造模，取得了良好的結(jié)果[8]。故本實(shí)驗(yàn)選取巴馬小型豬作為此次的模型動(dòng)物。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)巴馬豬來(lái)模擬臨床患者，制成與臨床相似的椎間盤退變模型，穿刺造模后1個(gè)月進(jìn)行MR檢查，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行穿刺的椎間盤出現(xiàn)間隙變窄，椎間盤后突，硬膜囊受壓，髓核信號(hào)缺失，纖維環(huán)變形等改變，按照Pfirrmann分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，處理后的椎間盤在Ⅲ～Ⅳ級(jí)。HE染色結(jié)果顯示，與Con組比較，Mod組內(nèi)的椎間盤髓核呈白色膠凍狀，穿刺部位椎間盤厚度下降，髓核發(fā)暗、含量減少，通道周圍組織廣泛硬化，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)粗糙。上述結(jié)果提示經(jīng)過(guò)細(xì)針穿刺后的椎間盤發(fā)生了明顯的的退行性改變。

總之，通過(guò)針刺破壞巴馬豬纖維環(huán)及椎間盤的方法，手術(shù)操作簡(jiǎn)單，可以獲得一種可靠的椎間盤退行病變模型，并且MR和病理學(xué)檢查可精確地驗(yàn)證模型的有效性。