齊衛(wèi)紅 程金偉 王金照 盧難看 王書元 修中飛 王 超 霍 艷 李芊芊

(1.中國食品藥品檢定研究院安全評價研究所，藥物非臨床安全性評價研究北京重點實驗室，北京 100176)(2.北京協(xié)尓鑫生物資源研究所有限責(zé)任公司，北京 102434)

獸醫(yī)在藥物安全性評價中起著至關(guān)重要的作用，在滿足藥物安全評價實驗順利進(jìn)行的同時，也要關(guān)注實驗中動物應(yīng)有的福利，使受試動物感覺舒適、營養(yǎng)充足、能夠自由表達(dá)天性，并且及時接受獸醫(yī)治療,履行國際實驗動物評估和認(rèn)可委員會[1](Association for assessment and accreditation of laboratory animal care，AAALAC)對動物福利保護(hù)的內(nèi)容。血糖是維持大腦功能的主要能量來源，實驗中動物出現(xiàn)低血糖癥狀，如救治不及時，極易造成腦損害致使動物死亡[2]，對實驗造成無法挽回的損失。中國食品藥品檢定研究院安全評價所開展一種降糖藥物(供試品A)4周的長期毒性研究。本文詳細(xì)歸納了研究中動物出現(xiàn)的癥狀，以及針對不同癥狀獸醫(yī)所采取的不同措施,并且以此為例，淺談獸醫(yī)在藥物安全評價中所起到的作用。

1 材料和方法

1.1 動物

Beagle犬，6月齡，25只雌性，25只雄性,共50只動物，普通級。繁育單位：北京瑪斯生物技術(shù)有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0001。

1.2 飼養(yǎng)環(huán)境

溫度：16～26 ℃，日溫差≤4 ℃；濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：至少8次/h；照明時間：12 h(上午8：00開燈～下午8：00關(guān)燈)；飼養(yǎng)籠種類：不銹鋼金屬籠(L×W×H：100 cm×75 cm×100 cm)；飼養(yǎng)密度：1只/籠。

1.3 飼料

犬用全價顆粒飼料,制造單位：北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.4 供試品與對照品

供試品:A批號：25L1151203;對照品：優(yōu)泌樂25,批號：C432081。

1.5 血糖檢測儀

羅氏卓越型血糖儀及配套試紙(德國羅氏診斷有限公司)。

1.6 實驗方法

1.6.1動物給藥途徑：皮下注射給藥，給藥部位為下肢皮下。

1.6.2給藥時間：每天給藥1次，每天上午給藥，連續(xù)給藥4周。

1.6.3分組及給藥劑量：見表1。

表1 動物實驗分組Table 1 Animal Groups

1.6.4血糖監(jiān)測方法：動物前肢乙醇消毒后使用放血針刺破皮膚，出血后使用血糖試紙采集血樣，用羅氏卓越型血糖儀檢測血糖數(shù)據(jù)。

1.7 低血糖判定標(biāo)準(zhǔn)及救治原則

1.7.1低血糖的判定標(biāo)準(zhǔn)：動物給予降糖藥后出現(xiàn)精神沉郁、體溫下降、少動、不能站立，步態(tài)強(qiáng)拘，表情冷漠，反射機(jī)能亢進(jìn)，呼吸急促，黏膜蒼白，全身強(qiáng)直性或間歇性抽搐[3-4]等癥狀，其中任何一項或幾項同時發(fā)生都視為低血糖表現(xiàn)，需及時取血檢測血糖值。血糖數(shù)據(jù)在2 mmol/L以下者確定為低血糖。本中心犬正常血糖均值雄性4.5～6.5 mmol/L，雌性4.2～6.7 mmol/L。

1.7.2低血糖的救治原則：應(yīng)在短期內(nèi)提高血糖濃度，改善低血糖癥狀，防范低血糖性腦損害的發(fā)生。注意維持病犬的正常體溫，降低腦水腫發(fā)生機(jī)會，具體步驟為先灌胃100 mL濃度25%蔗糖溶液，觀察動物10 min,癥狀是否改善。如改善，動物放回籠中休息。如無改善或有加重趨勢則立即采取靜脈滴注方式給予200 mL濃度5%葡萄糖溶液，速度90 mL/h。補(bǔ)液中觀察動物癥狀，如緩解可回籠休息。如補(bǔ)液過程中癥狀繼續(xù)加重如四肢抽搐、昏迷、躁狂等癥狀則靜脈推注20 mL25%葡萄糖溶液。給糖后動物癥狀恢復(fù)時再連續(xù)觀察4 h。定時補(bǔ)充飼料、飲水，增加觀察頻率。

2 結(jié)果

2.1 動物癥狀及血糖檢測

連續(xù)給藥15 d開始至給藥結(jié)束各給藥組動物陸續(xù)發(fā)生低血糖癥狀。癥狀發(fā)生在給藥后2～3 h，臨床觀察發(fā)現(xiàn)各組動物出現(xiàn)精神沉郁、雙目無神、眼瞼低垂，自主活動減少，趴臥籠中，肢體震顫，躁狂等低血糖癥狀。依據(jù)以上原則及時救治，確保實驗順利進(jìn)行。動物癥狀及血糖檢測結(jié)果見表2。

表2 動物癥狀及血糖值Table 2 Clinical symptoms and blood glucose values

2.2 特殊病例介紹

末次給藥后，20只動物短時間內(nèi)相繼出現(xiàn)低血糖癥狀，個別動物反復(fù)出現(xiàn)狀況，需要救治，占動物總數(shù)的40%。其中最為典型的雌性高劑量組FD504動物，給藥后2 h開始出現(xiàn)少動、俯臥等癥狀，檢測血糖值為1.0 mmol/L，動物抱出籠舍于治療區(qū),口服給予25%蔗糖液100 mL，3 min后動物站立、自由活動，動物抱回籠舍。30 min后再次巡視動物，發(fā)現(xiàn)FD504動物俯臥籠中、目光呆滯、四肢抽搐，將動物快速抱出籠舍，靜脈滴注5%葡萄糖溶液100 mL/h或90 mL/h。滴注60 mL后動物癥狀恢復(fù)，自由活動10 min后送回籠舍。給藥后4 h左右，巡視中發(fā)現(xiàn)FD504動物躺臥籠中，體溫下降，全身發(fā)涼，反射遲鈍，全身出現(xiàn)陣發(fā)性痙攣，很快陷入昏迷狀態(tài)。將動物抱出，快速進(jìn)行血樣采集、心電圖檢測、體溫測量(動物有生命體征時收集必要數(shù)據(jù))。動物靜推25%葡萄糖20 mL,熱水袋組成墊子為動物保溫，并給動物口服羊初乳+生理鹽水+25%蔗糖溶液100 mL。1h后動物意識恢復(fù)，可蹣跚站起。將動物移入籠中，籠底鋪熱水袋保溫。30 min后動物癥狀徹底恢復(fù)，自由進(jìn)食、飲水。

3 討論

3.1 實驗中獸醫(yī)的作用

實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南中規(guī)定“對所有動物都應(yīng)由受過培訓(xùn)、熟悉疾病癥狀的人員觀察其發(fā)病、外傷或異常行為等癥狀。”實驗開始前獸醫(yī)針對實驗可能致使動物發(fā)生低血糖的情況，對參與實驗人員進(jìn)行動物低血糖癥狀診斷、救治的培訓(xùn)。實驗中對發(fā)病動物及時施救。本次實驗中獸醫(yī)先期進(jìn)行培訓(xùn)，實驗中期面對動物大量、頻繁出現(xiàn)低血糖癥狀，及時向?qū)ｎ}負(fù)責(zé)人及中心動物管理和使用委員會(IACUC) 申請降低給藥劑量，高劑量組(A供試品)2.8IU/kg降為 2.1 IU/kg使實驗繼續(xù)開展。實驗中全體人員依據(jù)預(yù)案，及時施救確保動物全部完成實驗。

3.2 救治用藥

藥物臨床使用前安全性評價中為確保實驗的準(zhǔn)確性、客觀性、充分暴露供試品潛在的威脅，試驗期間對動物的異常癥狀應(yīng)盡量不用藥物干預(yù)。如外傷采取局部消毒，視傷口具體情況獸醫(yī)決定是否縫合。必須用藥時盡量采用藥理作用明確的藥物，盡量少對動物機(jī)體產(chǎn)生其他影響。本實驗中針對動物低血糖只采取口服補(bǔ)充蔗糖，靜脈補(bǔ)充葡萄糖及生理鹽水，軀體保暖等方式救治。

GLP條件下的藥物安全性評價中，對動物的使用與AAALAC要求的動物福利經(jīng)常存在一些矛盾。獸醫(yī)在實際工作中則需要協(xié)調(diào)二者關(guān)系，既要保證藥物安全性評價實驗順利進(jìn)行又要關(guān)注實驗動物福利，針對可能出現(xiàn)的對動物不利的情況采取必要的措施確保動物福利得到保障[5-6]。