宋銀娟 張茜茜 陳合花 廖 軼 段玉涵 吳 偉 孫 欣 王 璐 徐宏偉 姚 嬌 董浩迪 楊利峰 趙德明 周向梅

(中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，國家動物海綿狀腦病實驗室，北京 100193)

實驗動物是指在一定條件下人工飼養(yǎng)繁殖，具有特定的生物學特性，用于科學研究的動物。實驗動物在生命科學研究中起著不可替代的作用，實驗動物的健康狀況直接關系到實驗結果的可靠性和準確性[1]。因而，實驗動物的健康狀況在生命科學研究中至關重要。

本實驗室自2009年以來每年都對北京地區(qū)嚙齒類實驗動物質量進行病理學調查和分析。2017年5月對北京市16 家實驗動物單位的共330只嚙齒類實驗動物主要器官、組織進行樣品采集，組織切片制作，HE染色，部分組織進行了油紅O和PAS染色，然后進行病理學觀察和統(tǒng)計分析。調查結果顯示所抽檢的330例嚙齒類實驗動物總體處于健康狀態(tài)，但也有個別動物出現肝臟脂肪變性、肝臟局灶性壞死、肺萎陷、 小腸嗜酸性粒細胞增多及脾臟陳舊性出血等病變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2017年5月，由中國食品藥品檢定研究院從北京市16家實驗動物單位分別抽取一定數量的SPF級、清潔級的小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和普通級豚鼠四種實驗用鼠進行調查和分析，具體情況見表1。

表1 2017年5月嚙齒類實驗動物采樣情況Table 1 Classification of samples of laboratoryrodents in May 2017 只

1.2 實驗方法

1.2.1組織切片的制備和觀察: CO2窒息處死動物，采集動物的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、小腸和大腸。經甲醛鈣液(10%甲醛+1%氯化鈣)固定后按常規(guī)方法制作石蠟切片，HE染色，OLYMPUS U-SRG數碼顯微鏡觀察并采圖。

1.2.2肝臟油紅O染色：對HE染色觀察中有中度及以上細胞腫脹的肝臟樣品， 抽取部分樣品進行油紅 O 染色。主要步驟為： 組織塊用甲醛鈣液(10%甲醛 + 1% 氯化鈣)固定一周， 肝臟組織制作冰凍切片，油紅 O 染色，50%乙醇脫色，蘇木素復染核，甘油明膠封片后顯微鏡下觀察并采圖。

1.2.3肝臟PAS 染色:同時對HE染色觀察出現中度及以上細胞腫脹的肝臟樣品進行PAS 染色。主要步驟為:甲醛鈣液固定，制作肝組織石蠟切片，高碘酸氧化，Schiff 氏試劑染色，蘇木素復染細胞核，甘油明膠封片后顯微鏡下觀察并采圖。

2 結果

2.1 實驗鼠肝臟病理學變化及統(tǒng)計

2.1.1鏡下變化：顯微鏡觀察結果顯示，實驗鼠肝臟以細胞出現不同程度的腫脹變性為主，另有一例小鼠出現肝臟局灶性壞死。與正常肝臟(圖1 A)相比，肝細胞腫脹樣本鏡下可見肝細胞體積變大，胞漿內有大小不等、呈圓形或橢圓形的空泡，有的空泡融合在一起，胞核被擠向一側；也可見部分腫脹的肝細胞胞漿內呈顆粒狀，中央靜脈和肝血竇可見紅細胞(圖1B、C)。肝臟壞死樣本鏡下可見壞死區(qū)域肝細胞索結構消失，肝細胞胞核固縮、溶解、消失，胞漿淡染；部分壞死區(qū)域出現大量紅細胞。壞死區(qū)域周圍有少量呈圓形、細胞核藍染的淋巴細胞浸潤(圖1D)。

對肝細胞腫脹樣本進行油紅 O 染色,經顯微鏡觀察油紅 O 染色陽性的切片可見肝細胞輪廓和由蘇木素藍染的細胞核，胞漿內可見大量大小不一的圓形紅色脂滴，有的圍繞在細胞核周圍，有的聚集呈大脂滴(圖2A)。病變肝臟同時進行 PAS 染色，陽性樣本可見肝細胞胞核周圍有紫紅色顆粒物質異常沉積，與未著色部分形成明顯對比(圖2B)。

2.1.2病變情況統(tǒng)計: 病理學觀察結果顯示在140例小鼠樣本中，肝臟異常以細胞腫脹為主，經油紅O染色檢出脂肪變性2例，PAS染色確診糖原沉積6例，另出現1例肝臟局灶性壞死。肝臟病變檢出率6.4%。這可能與飼養(yǎng)環(huán)境和飼料不達標有關。大鼠肝細胞腫脹變性程度總體較嚴重，50例大鼠樣本中，經油紅O染色檢出4例脂肪變性，病變率8%。120例豚鼠樣本中，經油紅染色確診脂肪變性6例，PAS染色確診糖原沉積5例；其中，有2例SPF級豚鼠肝臟既有脂肪變性又有糖原沉積，肝臟病變率7.5%。20例金黃地鼠樣本肝臟均未見明顯病變。

圖1 肝臟HE染色(×40)注: A: 正常對照; B: 肝細胞腫脹; C: 肝臟空泡變性; D: 肝臟壞死灶Fig.1 Pathological changes of liver (HE ×40)Note: A: Normal liver; B: Hepatocellular swelling; C: Vacuolar degeneration; D: Focal necrosis

圖2 肝臟變化情況注: A: 肝臟油紅 O 染色陽性(×100); B: 肝臟 PAS 染色陽性(×40)Fig.2 Pathological changes of liverNote: A: Adipose degeneration (Oil Red-O staining, ×100); B: Glycogen deposition (PAS staining×40)

2.2 實驗鼠其他器官的病理學變化及統(tǒng)計

2.2.1脾臟病變:小鼠發(fā)現2例脾臟含鐵血黃素沉著(圖3B)，鏡下可見淋巴細胞分化完好，未見明顯異常，但局部區(qū)域可見大量吞噬了紅細胞的巨噬細胞即棕褐色的含鐵血黃素沉著。生理情況下在脾、肝、骨髓等組織內可形成少量的含鐵血黃素，但當含鐵血黃素局部沉積過多時，提示可能存在陳舊性出血。

圖3 脾臟HE染色(×40)注: A: 正常對照; B:含鐵血黃素沉著Fig.3 Pathological changes of spleen (HE×40)Note: A: Normal spleen; B: Hemosiderosis

2.2.2肺臟病變: 豚鼠肺臟檢出2例肺淤血，1例肺萎陷，病變率2.5%。與正常肺臟(圖4A)相比，肺淤血樣本可見整個肺臟有大量紅色物質淤積，肺泡結構不清，肺臟肺泡隔增寬；也可見細支氣管和較大的血管內充滿紅細胞。部分區(qū)域可見少量粉染的蛋白樣滲出物(圖4B、C)。肺萎陷樣本可見肺臟肺泡塌陷，肺泡隔顯著增厚，肺間質和肺泡腔內有紅細胞淤積(圖4D)。小鼠、大鼠、地鼠肺臟均未見明顯異常。肺臟出現淤血、萎陷和間隔增寬可能與飼養(yǎng)環(huán)境中的墊料、空氣等因素及管理、處死方式有關。

圖4 肺臟HE染色(×10)注: A: 正常對照; B、C: 肺臟淤血；D：肺萎陷Fig.4 Pathological changes of lung (HE×10)Note: A: Normal lung; B、C: Pulmonary congestion; D：Pulmonary collapse

2.2.3小腸病變: 清潔級大鼠檢出1例小腸嗜酸性粒細胞增多。顯微鏡觀察,低倍鏡下可見小腸黏膜上皮有脫落，黏膜固有層有大量嗜酸性粒細胞呈彌漫性浸潤(圖5A)。高倍鏡下可見嗜酸性粒細胞胞核呈分葉核、藍染，胞漿紅染(圖5B)。生理情況下在腸道存在少量的嗜酸性粒細胞，但當其大量增多時提示腸道可能有炎癥。

3 討論

本次調查顯示肝臟病變主要出現于小鼠、大鼠和豚鼠，金黃地鼠肝臟未見明顯異常。小鼠肝細胞腫脹主要是由于糖原沉積造成，另有一例肝臟局灶性壞死；大鼠肝臟以脂肪變性為主，且均發(fā)生在清潔級大鼠；而豚鼠肝細胞脂肪變性和糖原沉積參半。肺臟病變主要發(fā)生于豚鼠，表現為肺臟淤血、滲出及肺萎陷。另有一例大鼠小腸嗜酸性粒細胞顯著增多。兩例小鼠脾臟含鐵血黃素沉著。全部實驗鼠的腎臟、大腸等臟器在鏡下無明顯病理變化。綜上所述，絕大多數嚙齒類實驗動物為健康狀態(tài)，個別動物出現病變可能與飼養(yǎng)環(huán)境、飼料和飲水質量以及采樣運輸的應激有關。

近七年來，本實驗室共對3014例嚙齒類實驗動物的健康狀況進行了病理學調查。其中包括不同數量不同級別的小鼠、大鼠、豚鼠和地鼠。本次調查結果顯示病變主要發(fā)生于肝臟和肺臟。HE染色顯示肝臟總病變率為6.7%，油紅O染色確診肝臟脂肪變性率為3.6%，PAS染色確診肝臟糖原沉積率為3.3%。肺臟病變主要發(fā)生于普通級的豚鼠中，總病變率為0.9%。另小腸和脾臟總病變率為0.3%和0.6%。

圖6 2011年5月至 2017年5月北京市嚙齒類實驗動物病變檢出率注：A:肝臟病變率；B：肺臟病變率Fig.6 The detection rate of rodent laboratory animal pathological lesions in Beijing from 2011 to 2017Note: A: Rate of liver lesions; B: Rate of lung lesions

從歷年肝臟病變的統(tǒng)計分析來看(圖6A)，小鼠、大鼠和豚鼠的肝臟病變率均呈逐年下降的趨勢，豚鼠僅在2016年5月檢出肝臟病變，且病變率為5%。通常肝臟病變反映進食情況，而數據顯示不論動物級別如何，肝臟均有一定程度病變，說明肝臟損傷可能與飼料有關，而各受檢單位均使用目前市場上的成品飼料商品，可見其原料質量及配方有待規(guī)范。而飲水來源則根據級別要求使用自來水或高壓滅菌自來水，故不排除自來水水質如微生物含量，重金屬、消毒劑及農藥殘留和硬度等對實驗動物健康的影響。秋冬季低溫同樣不容忽視，在低溫環(huán)境下動物能量代謝加強， 需要通過增加采食量來維持熱平衡， 如果飼料供應不足，同樣會引起營養(yǎng)不良和抗病力下降，飼喂過度又易造成脂肪沉積，動物患肥胖病，故應規(guī)范飼喂量和飼喂次數[2-9]。

從歷年肺臟病變的統(tǒng)計分析來看(圖6B)，小鼠、大鼠及豚鼠肺臟病變發(fā)生率均呈波動趨勢，且每年秋季較為高發(fā)，2011年、2012年及2013年秋季肺臟病變檢出率均達到高峰。2014年以來，肺臟病變率呈下降趨勢。肺臟病變主要反映飼養(yǎng)環(huán)境空氣情況，歷年的調查結果顯示，普通級的實驗鼠肺臟病變檢出率均較高?？梢娖胀墑游锏目諝饧皦|料有待改善， 原因可能有墊料不合格及飼養(yǎng)密度過大等。劣質的墊料碎屑及塵埃較多，極易造成異物刺激引發(fā)動物肺部炎癥；飼養(yǎng)密度過大、溫濕度不適、通風不良和飼養(yǎng)員清理不及時，室內臭味和氨濃度升高容易誘發(fā)氣管炎、肺炎等。因而，在實驗動物的飼養(yǎng)過程中需要注意飼養(yǎng)環(huán)境的空氣情況、飼養(yǎng)密度以及通風情況等，盡量減少室內墊料碎屑、臭味和氨味等對動物呼吸道的刺激[2-9]。

國際公認的動物福利標準是由世界動物衛(wèi)生組織提出的動物應享受的五大自由：即享有不受饑渴的自由，享有生活舒適的自由，享有不受痛苦傷害和疾病威脅的自由，享有生活無恐懼和悲傷感的自由，享有表達天性的自由。實驗動物福利要求在兼顧科學探索的基礎上最大限度地滿足實驗動物的五大自由[10]。 本實驗室連續(xù)七年的病理學調查都能觀察到嚙齒類實驗動物的不同臟器出現不同程度的組織病理學損傷，主要有肝臟脂肪變性、肝臟局灶性壞死、間質性肺炎、脾炎、心肌出血、腎臟蛋白樣滲出以及腸道寄生蟲等[3]，這些損傷證明實驗動物單位的實驗動物的飼養(yǎng)管理水平良莠不齊，個別沒有達到實驗動物的福利標準，部分實驗動物處于亞健康狀態(tài)。使用處于亞健康狀態(tài)的實驗動物對科學研究實驗結果的可靠性和準確性會產生影響。雖然在每次實驗動物的質量評價中，被檢測動物的微生物學、寄生蟲學和遺傳學等指標都能達到或符合國家質量標準，但在病理學檢測中都能觀察到不同程度的組織病理學損傷。因而，通過病理學監(jiān)測實驗動物的健康狀況對于更好地保障實驗動物的福利和保證科學研究結果的可靠性和準確性都具有重要的意義。