（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

牛奶是最古老的天然飲料之一，被譽(yù)為“白色血液”[1]。酪蛋白是牛奶中的主要蛋白，占牛奶中蛋白質(zhì)總量的80%[2-3]，且是牛奶中主要的過(guò)敏原。本實(shí)驗(yàn)以牛奶中的酪蛋白為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)目標(biāo)蛋白的分離純化，進(jìn)行電泳分析鑒定[4-5]。為牛奶過(guò)敏蛋白的檢測(cè)以及標(biāo)準(zhǔn)品的制備，提供一定的基礎(chǔ)性研究。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料與試劑

原料：科迪純牛奶，伊利純牛奶，揚(yáng)大巴氏鮮牛奶。

試劑：丙酮、酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；十二烷基硫酸鈉（SDS）、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R250、蛋白Marker等，購(gòu)自上海生物工程股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、H5-6多頭磁力加熱攪拌器、微型垂直電泳系統(tǒng)、凝膠電泳成像儀、臺(tái)式pH計(jì)、電子天平、恒溫水浴鍋、脫色搖床。

1.3 酪蛋白粗提和純化

將3種牛奶倒入離心瓶中低溫離心去脂肪，過(guò)濾得脫脂奶，調(diào)節(jié)pH至4.6；后在4 ℃條件下離心獲沉淀為酪蛋白；加入等量的丙酮進(jìn)一步脫脂，抽濾清洗，留樣電泳分析。將樣品置于透析袋透析36 h后，取出進(jìn)行冷凍干燥。

1.4 蛋白含量測(cè)定以及電泳分析

以蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱(chēng)取3種牛奶樣品中粗提的和純化的蛋白測(cè)量吸光度值，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)濃度，并采用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品蛋白含量測(cè)定

通過(guò)檢測(cè)標(biāo)品吸光度，可建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，即y=0.027 9x+0.071 8（R2=0.999 3），帶入樣品蛋白的吸光度值測(cè)出各樣品蛋白濃度，見(jiàn)表1。

表1 樣品蛋白濃度表

由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程以及樣品蛋白的吸光度值測(cè)得樣品中的蛋白濃度，可以得出3種樣品的粗提蛋白濃度均小于純化后的蛋白濃度，而在純化蛋白中科迪鮮奶的蛋白濃度最高，粗蛋白中伊利鮮奶的蛋白濃度最高。

2.2 SDS-PAGE分析

將純化后的酪蛋白組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，用凝膠成像與分析系統(tǒng)對(duì)電泳圖進(jìn)行光密度掃描，結(jié)果以28 kD區(qū)帶處蛋白條帶含量最為明顯。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[1]并結(jié)合圖1可知，酪蛋白為牛奶中主要的過(guò)敏原蛋白組分。

圖1 樣品的SDS-PAGE分析圖

3 結(jié)論

通過(guò)提取純化酪蛋白，以及SDS-PAGE電泳分析的結(jié)果，驗(yàn)證了酪蛋白是牛奶中的主要過(guò)敏原蛋白，與其他文獻(xiàn)[6]報(bào)道相符。酪蛋白的提取條件為4 ℃離心，pH 4.6，此條件下可得的酪蛋白濃度為2.02 mg/mL。