（陜西省產品質量監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710048）

肉及肉制品的摻假問題是長期以來一直存在的問題，如在售價較高的牛羊肉中摻入價格低廉的豬肉，甚至鴨肉、雞肉等，且摻假者造假手段越來越高明，一般的感官檢驗難以區(qū)分，因此對肉品的種屬進行鑒定是當前食品安全檢測研究的方向之一。目前，對于摻假肉鑒別方法主要有紅外光譜分析法、色譜法、質譜法、酶聯免疫法和分子生物學方法[1]，其中以物種間基因差異為基礎的分子生物學方法是當前研究的熱點。

本文中進行質量評價的聯合檢測試劑盒，是根據動物種間線粒體基因的多態(tài)性差異，分別設計特異性引物，利用實時熒光PCR聯合檢測方法，在一個PCR反應體系內同時對多個物種的特異性片段進行擴增，通過加入熒光染料SYBR來檢測熒光信號，最后通過擴增的Ct值與對照內參的Ct值來確定陰陽性，從而建立的一種能夠同時測定肉制品中多種動物源成分的實時熒光PCR聯合檢測方法。該方法可以同時對肉及肉制品中多種動物源性成分（豬、牛、羊、雞、鴨、鵝；驢、馬、狗、兔、貓、鼠等）的單一肉制品或多種動物的混合肉制品進行檢測鑒定，能夠檢測到的摻假比例為1%[2]。本文通過該試劑盒對本實驗室保存的肉和市售肉及肉制品的檢測，證實對于不同加工處理的肉制品，所設計的聯合檢測試劑盒均可準確檢測目的種源肉。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

①儀器：ABI 7500型實時熒光PCR擴增儀，美國Life公司；旋渦混合器，海門市其林爾儀器制造公司；數顯電熱恒溫水浴箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。②試劑：組織DNA提取試劑盒，DEAOU公司；肉及肉制品聯合檢測試劑盒，陜西瑞奇生物科技有限公司；試劑盒SR1，可區(qū)分豬、牛、羊、雞、鴨、鵝；試劑盒SR2，可區(qū)分驢、馬、狗、兔、貓、鼠。

1.2 樣本來源

本試驗所用的樣本來自于本實驗室在-18 ℃冷凍保存的已知動物種源成分的生肉，以及購買自本地各大型商超售賣的肉干制品、火腿、肉罐頭等肉制品，還有個別購買于早點攤的肉包。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本DNA提取

①對食品樣品進行均質處理，將不同類型的樣品分開處理，防止不同動物種源食品的交叉污染。②按照組織基因組DNA提取試劑盒方法提取樣品DNA。根據樣本情況，取組織10～30 mg，加入230 μL裂解液和20 μL蛋白酶K，55 ℃水浴消化2～3 h，離心取上清液，加入250 μL柱平衡液，70 ℃水浴1 min，加入250 μL無水乙醇，混勻后上DNA吸附柱，將DNA從吸附柱上洗脫下來，-20 ℃保存、備用。

1.3.2 實時熒光PCR聯合檢測的體系及反應條件

實時熒光PCR反應體系的總體積為20 μL，其中酶反應液10 μL、雙蒸水8 μL、檢測引物（不同動物種源引物或者內參、陰性對照的引物）1 μL，10倍稀釋后的樣本模板DNA 1 μL或陰性對照1 μL。PCR反應條件為：預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)，熔解曲線為 60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。

1.3.3 結果判定

每個樣本同時用SR1試劑盒和SR2試劑盒進行檢測。判斷方法為：用擴增的樣本Ct值與內參的Ct值比對，從而確定擴增樣本中是否含有特異引物對應的動物種源。當樣本擴增Ct值與內參擴增的Ct值的差值的絕對值≥7時，則判定為陰性，即說明該樣本中未檢出特異引物對應的動物源成分，當樣本擴增Ct值與內參擴增的Ct值的差值的絕對值＜7時，則判定為陽性，即說明該樣本中檢出特異引物對應的動物源成分。

2 結果與分析

2.1 對生肉制品的檢測結果

生肉樣本共計16份，對其分類，見表1。

表1 16個生肉樣本的不同分類表

使用該聯合檢測試劑盒對表1中生肉進行實時熒光PCR檢測，Ct值及判定結果見表2。檢測結果表明：通過該試劑盒檢出的16份生肉樣本中的動物種源成分均與已知動物種源相符。說明該聯合檢測試劑盒可準確檢測生肉樣本的動物種源成分。

表2 兩種聯合檢測試劑盒對16個生肉樣本進行實時熒光PCR檢測的Ct值與動物種源判定結果表

2.2 對熟肉制品的檢測結果

熟肉樣本共計34份，對其分類，見表3。

表3 34個熟肉樣本的不同分類表

使用該聯合檢測試劑盒對表3中熟肉制品進行了實時熒光PCR檢測，Ct值及判定結果見表4。檢測結果表明：32份商超購買的樣本通過該試劑盒檢出的動物種源成分均與樣本標簽標注的動物種源相符。購自早點攤的兩個樣本，其中38號僅檢出豬源性成分，與樣本標稱動物源成分相符合，而37號樣本不僅檢出樣本標稱的牛源性成分，還檢出樣本未標稱的豬源性成分，說明該樣本存在摻假問題。這34份熟肉制品的實時熒光PCR檢測分析結果表明：該聯合檢測試劑盒可準確檢測熟肉制品的動物種源成分。

表4 兩種聯合檢測試劑盒對34個熟肉樣本進行實時熒光PCR檢測的Ct值及動物種源判定結果表

續(xù)表4

3 討論

針對肉制品中動物種源，該聯合檢測試劑盒不但可以檢測單一動物種源的肉，還可以同時檢測出混合肉中相應的動物種源成分；不但能夠檢測未經加熱處理的生肉及其制品，還能夠檢測經過長時間高溫處理過的肉及肉制品的相應的動物種源成分，對各物種的靈敏度為1%。

該試劑盒不用設計特異性探針，通過與內參比對判定陰陽性，能夠排除因沾染而造成的假陽性結果，同時由于內參和對照的存在，可以避免因為DNA的含量太少而導致的假陰性結果。

使用該試劑盒檢測時，樣本模板中DNA的最適濃度為50 ng/μL，該濃度下內參的Ct值約在15[2]。由于本次驗證工作未進行所有樣本核酸濃度的檢測，僅檢測其中5個樣本的模板核酸濃度為100～1 000 ng/μL，在利用該試劑盒進行檢測時，對所有樣本模板進行10倍稀釋，即最終上機檢測的樣本模板的核酸濃度為10～100 ng/μL，結果導致內參的Ct值在8～12，樣本的Ct值在7～25這樣一個較寬的區(qū)間。但是，由于最終的判定依據是內參的Ct值和樣本Ct值的差值，即使在這樣不完全確定核酸濃度的檢測條件下，仍能夠得到正確的檢測結果，說明該試劑盒對模板的核酸濃度不需要太嚴格的要求。

綜合分析，本研究驗證的實時熒光PCR聯合檢測試劑盒能一次擴增出多種不同種類肉品對應的特異性DNA片段，可用于肉及肉制品動物源成分的真?zhèn)舞b別及摻假情況判定，特異性強，靈敏度高，操作簡便，基本可以滿足市場對肉及肉制品種源鑒別檢測的要求。