井崗山，江志強

（1.山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院，山東 肥城 271608；2.山東省即墨市人民醫(yī)院，山東 即墨 266200）

膀胱癌作為常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤首位，具有多發(fā)、易復發(fā)等特點，且復發(fā)后腫瘤惡性程度增加，嚴重威脅人類健康[1]。目前，該腫瘤的發(fā)病及復發(fā)機制尚不清楚。microRNA（miRNA）作為一類高度保守的非編碼短小RNA，在細胞增殖、分化、凋亡、器官發(fā)育、免疫等多種生理功能中發(fā)揮重要作用，亦參與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程[2]。研究表明，膀胱癌患者外周血miRNA表達譜發(fā)生異常[3]。microRNA-192（miR-192）作為miRNA重要類型，在多種惡性腫瘤組織中表達異常，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程[4]。亦有研究指出，miR-192表達失調(diào)可能在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition, EMT）過程中發(fā)揮重要作用[5]。而EMT參與與惡性腫瘤細胞增殖、遷移及耐藥過程。本研究對膀胱癌組織中miR-192、EMT相關(guān)指標進行檢測，并與正常膀胱黏膜組織進行比較，探討其在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的意義，為膀胱癌機制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年5月-2015年6月在山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院泌尿外科擇期行手術(shù)治療的膀胱癌患者96例作為膀胱癌組，均經(jīng)病理學診斷證實為膀胱上皮移形細胞癌。其中，男性62例，女性34例；年齡37～74歲，平均（63.8±9.7）歲；初發(fā)腫瘤62例，復發(fā)腫瘤34例；單發(fā)腫瘤55例，多發(fā)腫瘤41例；病理學分級：高分化32例，中低分化64例；TNM分期：T0、T1期38例，T2～T4期58例。同期留取外傷性膀胱破裂患者正常膀胱黏膜組織41例作為對照組，均經(jīng)病理學診斷證實為正常膀胱黏膜組織。其中，男性29例，女性12例；平均年齡（61.9±8.2）歲。兩組患者性別、年齡等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。將留取的膀胱癌及正常膀胱黏膜組織迅速放入液氮中，保存于-80℃冰箱以備檢。本研究通過本院倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.2 主要試劑及設(shè)備

Trizol總RNA提取試劑盒（美國Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應試劑盒購自上海拜力生物科技公司，miR-192及內(nèi)參U6、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子1（zinc finger transcription factor 1, ZEB1）及內(nèi)參β-actin引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成，兔抗人ZEB1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），鼠抗人E鈣黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗體（北京中杉公司），鼠抗人波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）儀（美國ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 采用qRT-PCR檢測不同組織中miR-192和ZEB1基因的表達。取凍存組織，研磨后加入細胞裂解液，用Trizol總RNA提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。逆轉(zhuǎn)錄獲得模板單鏈cDNA，以cDNA為模板進行PCR。miR-192正向引物 ：5’-CTGACCTATGAATTGACAGCC-3’，反向引物：5’-CAGTGCAGGGTCCGACCTATT-3’；U6正向引物：5’-TCAGTTTGCTGTTCTGGGTG-3’，反向引物：5’-CGGTTGGCTGGAAAGGAG-3’；ZEB1正向引物：5’-GCACAACCAAGTGCAGAAGA-3’，反向引物：5’-CATTTGCAGATTGAGGCTGA-3’；β-actin正向引物：5’-TGGCACCACACCTTCTACA-3’，反向引物：5’-AGCACAGCCTGGATAGCA-3’。PCR反應條件：94℃預變性1 min，92℃變性30 s，56℃退火30 s，74℃延伸30 s，共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個平行反應復孔。采用2-△△Ct法計算組織中miR-192和ZEB1基因的相對表達量。

1.3.2 免疫組織化學法 采用免疫組織化學法檢測不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin的表達。取不同組織，用4%甲醛固定后，石蠟包埋、切片，厚約5μm。經(jīng)脫蠟、水化、微波抗原修復、過氧化氫孵育，滴加一抗兔抗人ZEB1、E-cadherin和Vimentin多克隆抗體（稀釋比例1∶300、1∶800和1∶1 000），4℃濕盒過夜孵育，加入通用型二抗，37℃濕盒孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色劑顯色，蘇木精復染，分化、返藍、脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：ZEB1主要以細胞質(zhì)和細胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色團塊狀或顆粒狀染色為陽性，E-cadherin和Vimentin主要以細胞膜出現(xiàn)黃色、棕褐色均質(zhì)染色為陽性。在高倍鏡下隨機選取5個視野，根據(jù)著色細胞比例進行判定：＜90%為表達異常，≥90%為表達正常。

1.3.3 Western blot檢測 采用Western blot檢測不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表達。取組織研磨后加入細胞裂解液，對總蛋白進行提取，用BCA法對蛋白濃度進行檢測。取蛋白30μg，用10% SDS-PAGE進行電泳分離，經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉在室溫下封閉60 min，分別加入一抗兔抗人ZEB1多克隆抗體、鼠抗人E-cadherin多克隆抗體和鼠抗人Vimentin單克隆抗體（稀釋比例分別為1∶500、1∶1 200和1∶2 000），過夜孵育，用TBST漂洗3次，將HRP標記的IgG二抗加入（稀釋比1∶1 000），室溫下孵育60 min，TBST漂洗3次，ECL化學發(fā)光顯色液顯色。采用Quantity One圖像分析軟件對獲得的電泳條帶進行分析，計算不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，相關(guān)性分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中miR-192和ZEB1基因表達水平比較

2.1.1 miR-192 膀胱癌與對照組組織中miR-192相對表達量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），膀胱癌組織中miR-192相對表達量低于對照組。見表1。

2.1.2 ZEB1 mRNA 膀胱癌與對照組組織中ZEB1 mRNA相對表達量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），膀胱癌組織中ZEB1 mRNA相對表達量高于對照組。見表1。

表1 不同組織中miR-192和ZEB1基因表達水平比較（±s）

表1 不同組織中miR-192和ZEB1基因表達水平比較（±s）

組別 miR-192 ZEB1 mRNA膀胱癌組（n =96） 0.58±0.07 0.61±0.09對照組（n =41） 0.93±0.11 0.32±0.06 t值 23.686 18.279 P值 0.000 0.000

2.2 膀胱癌組織中miR-192和ZEB1基因表達水平與臨床病理特征的關(guān)系

膀胱組織中miR-192和ZEB1 mRNA表達水平與年齡、性別、發(fā)病階段、腫瘤數(shù)量及腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），與病理學分級、TNM分期及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。見表 2。

2.3 不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表達

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，ZEB1主要表達于細胞質(zhì)和細胞核，在膀胱癌組織中呈高表達；E-cadherin主要表達于細胞膜，在膀胱癌組織中呈低表達；Vimentin主要表達于細胞膜，在膀胱癌組織中呈高表達。見圖1。

2.4 不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平比較

Western blot結(jié)果顯示，膀胱癌和對照組組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），膀胱癌組織中ZEB1和Vimentin蛋白表達水平高于對照組，E-cadherin蛋白表達水平低于對照組。見表3和圖2。

2.5 膀胱癌組織中miR-192與ZEB1、E-cadherin、Vimentin蛋白表達水平的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，膀胱癌組織中miR-192與ZEB1、Vimentin蛋白表達水平呈負相關(guān)（r=-0.279和-0.318，均P=0.000），與E-cadherin蛋白表達水平呈正相關(guān)（r=0.376，P=0.000）。

表2 不同影響因素膀胱癌組織中miR-192和ZEB1基因表達水平比較

圖1 不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表達 （免疫組織化學法×20）

表3 不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平比較 （±s）

表3 不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平比較 （±s）

組別 ZEB1蛋白 E-cadherin蛋白 Vimentin蛋白膀胱癌組（n =96） 1.27±0.15 0.51±0.10 1.34±0.13對照組（n =41） 1.09±0.12 0.78±0.14 1.12±0.11 t值 6.515 11.770 7.594 P值 0.000 0.000 0.000

圖2 不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表達

3 討論

膀胱癌作為泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤，發(fā)病率高、復發(fā)率高，且每次復發(fā)后惡性程度常增加[6]。有研究指出，miRNA參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程，且與膀胱癌復發(fā)有關(guān)[7]。miR-192作為miRNA類型之一，參與胃癌[8]、肺癌[9]、子宮內(nèi)膜癌[10]等多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程。亦有研究指出，miR-192過表達可抑制人膀胱癌細胞增殖，誘導凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中miR-192表達水平低于對照組，說明miR-192在膀胱癌組織中呈低表達，可能參與膀胱癌發(fā)生過程；膀胱組織中miR-192表達水平與病理學分級、TNM分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，病理學分級越低、TNM分期越高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，miR-192表達水平越低，進一步說明miR-192低表達參與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程，可能發(fā)揮抑癌基因功能。

有研究表明，EMT在腫瘤細胞原位浸潤及遠處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。EMT出現(xiàn)異常時，可導致細胞表型及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使上皮細胞極性喪失、間質(zhì)特性增強，從而使細胞間黏附力減弱甚至消失，加速細胞遷移及轉(zhuǎn)移[12]。ZEB1作為EMT過程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可通過與E盒位點結(jié)合而參與EMT過程[13]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中ZEB1 mRNA和蛋白表達水平高于對照組，說明ZEB1在膀胱癌組織中表達異常，且病理學分級越低、TNM分期越高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，ZEB1 mRNA表達水平越高，說明ZEB1在膀胱癌組織中呈高表達，可能通過EMT過程而參與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。E-cadherin作為介導細胞間黏附的跨膜糖蛋白，其表達降低或缺失可使細胞間黏附力降低，是EMT發(fā)生的標志[14]。Vimentin蛋白作為纖維蛋白，是EMT發(fā)生的重要標志物，其表達水平越高往往預示腫瘤惡性程度越高[15]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中Vimentin蛋白表達水平高于對照組，而E-cadherin蛋白表達水平低于對照組，進一步說明EMT可能參與膀胱癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程。Pearson相關(guān)性分析顯示，膀胱癌組織中miR-192與ZEB1、Vimentin蛋白表達水平呈負相關(guān)，與E-cadherin蛋白表達水平呈正相關(guān)，說明miR-192低表達可能通過負性調(diào)控ZEB1而參與EMT過程，從而促使膀胱癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-192在膀胱癌組織中呈低表達，而ZEB1呈高表達，miR-192可能通過負性調(diào)控ZEB1，促進EMT過程，從而加速膀胱癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。