王丹丹 遲春寧 白晶 陳沖 池春玉，2 丁國華，2

（1. 哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院，哈爾濱 150025；2. 植物生物學黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱 150025；3. 哈爾濱市第六中學，哈爾濱 150036）

水楊酸（SA）是植物產(chǎn)生過敏反應（Hypersensitive Reaction，HR）和系統(tǒng)獲得抗性（Systemic Acquired Resistance，SAR）的內(nèi)源信號分子，可以誘導抗病基因表達，在植物的SAR信號轉導中起關鍵作用［1］。有很多研究證實SA介導的HR是一個程序性細胞死亡（Programmed cell death，PCD）過程［2-3］。植物發(fā)生HR時，常伴隨著特異性信號分子ROS和SA的積累以及染病相關基因（PR）的表達，激發(fā)鄰近組織的特異性防御反應和植株的SAR［4］。線粒體在 PCD 中扮演重要角色［5］。線粒體通透性轉運孔（Mitochondria permeability transition pore，MPTP）的開放是PCD中發(fā)生的最早事件［6］。MPTP的開放引起線粒體膜電位下降，進一步導致氧化磷酸化作用的解偶聯(lián)，膜內(nèi)外離子濃度趨于平衡，進而導致線粒體外膜被破壞和細胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）的釋放，釋放到胞質(zhì)內(nèi)的Cyt C可以激活Caspase等下游關鍵酶類，使信號級聯(lián)放大而觸發(fā) PCD［7-8］。Efthimios［9］研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫處理煙草植株，短時間鹽脅迫出現(xiàn)線粒體膜去極化、Cyt C釋放和Caspase蛋白含量變化。Janneke［10］研究發(fā)現(xiàn)黃瓜子葉在55℃高溫處理，出現(xiàn)DNA梯狀條帶現(xiàn)象，且通過Western blot技術檢測發(fā)現(xiàn)Cyt C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中［8］。線粒體中新發(fā)現(xiàn)的PCD組分揭示了線粒體在植物中觸發(fā)和執(zhí)行PCD的功能。李家洋研究組通過對mod1抑制基因的研究發(fā)現(xiàn)，植物的程序性細胞死亡途徑中存在葉綠體到線粒體的信息交流，蘋果酸-草酰乙酸穿梭途徑在其中發(fā)揮關鍵作用。ROS可以作為誘導線粒體膜透化或線粒體通透性轉換孔（MPTP）形成的誘導PCD的信號分子，通過Cyt C的釋放和線粒體電子傳遞鏈（mETC）執(zhí)行PCD［11］。

目前在水稻、玉米、擬南芥等植物中分離出一些與PCD相關的基因，如與玉米性器官原基退化有關的Ts2基因，大麥中的抗白粉病Mlo基因，擬南芥調(diào)控PCD的LSD1基因和與HR反應有關的3個基因AP22A，AP33A和AP43A［12-13］。但植物PCD的研究開展較晚，PCD相關基因的研究遠沒有動物深入，需要分離更多的基因來揭示植物PCD的機制。RNA-seq測序技術是一種轉錄組測序手段，在已完成基因組測序的物種中，通過將RNA-seq結果與基因組DNA序列數(shù)據(jù)進行比對，從而得到差異表達基因、新基因等［14］。

利用10 mmol/L SA誘導處理黃瓜葉片，檢測到黃瓜發(fā)生了PCD，并伴隨著ROS的積累和H2O2產(chǎn)生。獲取黃瓜受SA誘導的PCD相關基因，研究受SA誘導的PCD相關基因與黃瓜抗病的相關性，從中獲取黃瓜抗病相關線粒體基因，為揭示SA誘導黃瓜PCD和提高黃瓜抗病性的分子機制提供基礎。本文根據(jù)對RNA-seq測序得到1759個差異表達基因（DEGs）結果進行篩選［15-16］，得到16個與線粒體相關的DEGs。通過qRT-PCR技術分析該16個基因在SA和霜霉病處理下的表達特征，為獲取介導PCD的關鍵基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗于2016年5月哈爾濱師范大學植物分子生物學實驗室進行。供試黃瓜自交系9930由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所黃三文教授實驗室贈送。幼苗在光照培養(yǎng)箱內(nèi)用Hoagland營養(yǎng)液蛭石培養(yǎng)，光照28℃/14 h，黑暗24℃/10 h。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 第4片真葉長出時選長勢良好的黃瓜幼苗在第3片真葉的葉脈間滴加10 mmol/L的SA（每葉4滴，每滴50 μL），并于滴加前（0 h）和滴加后3 h、12 h、24 h取材4次，每次隨機選取3株植株，摘取滴加SA的第3片真葉無菌水洗凈揩干，剪取滴加SA部位混合均勻，提取RNA。

選取霜霉病發(fā)病的新鮮葉片，用蒸餾水清洗干凈，放入密封袋，20℃下放置24 h，用毛筆刷取葉片上新長出的孢子囊于無菌水中，制成霜霉菌菌液，濃度為5×105-10×105個孢子囊/mL。采用滴加法接種病菌，選取長勢良好的四葉期黃瓜植株，在第3片真葉的葉脈間滴加菌液，每葉9滴，每滴50 μL，保濕24 h。于滴加前（0 h）和滴加后36 h、72 h和96 h取材4次，每次隨機選取3株植株摘取滴加菌液的第3片真葉無菌水洗凈揩干，剪取接菌部位混合均勻，提取RNA。

1.2.2 qRT-PCR測定 上述保存材料的總RNA提取采用天根生化科技有限公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（離心柱型），詳細方法見試劑盒說明書。cDNA合成采用寶生物公司的PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒。

根據(jù)基因注釋中是否含有mitochondrial，從1759個 DEGs中［12］篩選出 16個基因（表 1）。根據(jù)公布的黃瓜基因組基因系列設計出qRT-PCR引物如表1，以18S為內(nèi)參基因（引物為ATGATAACTCGACGGATCGC和CTTGGATGTGGTAGCCGT），進行qRT-PCR測定。qRT-PCR采用大連寶生物SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒，采用 2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，確定基因的相對表達量。

表1 被篩選的16個相關基因及其PCR表達分析引物

2 結果

16個被分析基因的qRT-PCR表達如表2描述，按照基因響應SA和霜霉菌的一致性，可以將這些基因劃分為3類。

第一類基因的表達量在響應SA和霜霉菌上基本一致，都是隨處理時間延長，表達量持續(xù)上調(diào)，或上調(diào)至一定程度后下調(diào)，個別下調(diào)至處理前水平，且上調(diào)幅度都比較大（500%以上）。屬于這類的基因有A、B、F、H、J、L（圖1）。在表達時間段上，H上調(diào)響應SA和霜霉菌集中在早期，特別是響應霜霉菌。J上調(diào)響應SA在12 h達到最高，響應霜霉菌在36 h最高。L是逐步上調(diào)響應SA和霜霉菌，響應SA是12 h達到最大，響應霜霉菌是96 h達到最大。

第二類基因的表達量在響應SA和霜霉菌時雖然一致，但表達量差別很大（圖2）。G和P基因都是上調(diào)，但上調(diào)幅度都很小，最大為處理前的3倍。I基因顯著響應SA，但上調(diào)響應霜霉菌較微弱，而K基因正好相反，上調(diào)響應SA很微弱，但響應霜霉菌很強烈，上調(diào)幅度最大達到17倍。M基因與K基因相似。

第三類基因在響應SA和霜霉菌上不一致，基本是上調(diào)響應SA，下調(diào)響應霜霉菌，屬于這類是基因是C、D、E、N和O（圖3）。其中只有N和O基因響應SA的上調(diào)表達量較高，最大表達量高于處理前10倍，N響應霜霉菌顯著下調(diào)約5倍，而O基本不響應霜霉菌。C、D、E雖然都上調(diào)響應SA或下調(diào)響應霜霉菌，但響應幅度都不大，約2-3倍。

表2 被篩選的16個相關基因的qRT-PCR表達分析

圖1 qRT-PCR檢測A、B、F、H、J和L基因在滴加SA（（A）和接種霜霉菌（B）的葉片中的表達分析

圖2 qRT-PCR檢測G、I、K、M和P基因在滴加SA（A）和接種霜霉菌（B）的葉片中的表達分析

圖3 qRT-PCR檢測C、D、E、N和O基因在滴加SA（A）和接種霜霉菌（B）的葉片中的表達分析

3 討論

3.1 SA和霜霉病處理黃瓜葉片實時熒光定量PCR表達差異分析

通過實時熒光定量技術分析SA處理和霜霉病處理下，黃瓜葉片的16個線粒體相關基因呈現(xiàn)相似或相悖的表達趨勢，說明SA誘導的PCD相關基因在霜霉病誘導的PCD信號通路中也行使功能。SA與霜霉病對基因表達量的影響具有一定的相似性。其中線粒體丙酮酸載體2（A）、抑制素3（B）、雙磷脂酰甘油脫酰酶（F）、解耦聯(lián)蛋白5（G）、線粒體肉堿/?；鈮A載體（H）、甲酸脫氫酶1（I）、氨基丁酸氨基轉移酶1（J）線粒體內(nèi)膜轉移酶亞家族（K）、脯氨酸脫氫酶2（L）、丙酮酸脫氫酶E1α（M）和乙酰鳥氨酸轉氨酶（P）11個基因在霜霉病處理中結果與SA處理相似皆為上調(diào)。SA與霜霉病對基因表達量的影響也具有一定的差異性，其中3-羥基異丁酰CoA水解酶（C）、分子伴侶60N-2（D）、甘氨酸脫羧酶（E）、延伸因子Tu（O）和亮氨酸拉鏈結構域跨膜蛋白1（N）5個基因在SA處理中為上調(diào)表達，在霜霉病處理過程中也為下調(diào)表達。按照基因響應SA和霜霉菌的一致性，又可以將這些基因劃分為3類。第一類基因的表達量在響應SA和霜霉菌上基本一致，屬于這類的基因有A、B、F、H、J、L。第二類基因的表達量在響應SA和霜霉菌時雖然一致，但表達量差別很大，屬于這類的基因有G、I、M、K、P。第三類基因在響應SA和霜霉菌上不一致，基本是上調(diào)響應SA，下調(diào)響應霜霉菌，屬于這類是基因是C、D、E、N和O。說明SA處理下和霜霉病處理下基因的表達存在差異，可能由于SA和霜霉病引發(fā)的黃瓜葉片PCD發(fā)生方式不同有關。植物類病變（Lesion mimic，LM）又稱類病斑，指在正常生長條件下，即無明顯機械損傷、逆境和外界病原菌侵染，植物的局部或整株上自發(fā)產(chǎn)生壞死斑點。這種現(xiàn)象最早在玉米中被發(fā)現(xiàn)，隨后大麥、擬南芥、水稻等植物中也相繼報道了該表型的突變體。近年來，隨著多個水稻類病變突變體的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，水稻類病變基因的定位、克隆及作用機理等方面的研究取得了較大進展。SA參與類病斑的產(chǎn)生，SA誘導的PCD就是一種類病斑，因此研究黃瓜的類病斑或者SA誘導的類病斑，分離和鑒定相關基因，對揭示黃瓜的抗病機制和遺傳育種都有積極意義［17-18］。病原體侵害引發(fā)抗病信號途徑有很多種也存在差異，SA處理黃瓜葉片，被侵染部位發(fā)生局部壞死（即Hypersensitive response，HR），細胞內(nèi)ROS的爆發(fā)引起PCD的發(fā)生，以抵抗病原菌的的進一步擴散；非染病部位則長期保持一種抵抗這種病原和其他病原的抗性即系統(tǒng)獲得抗性［19］。HR和SAR相互作用發(fā)生的病原相關蛋白（Patho-genesis related proteins，PRs）基因的表達中增強，引發(fā)植物的多種信號轉導途徑。霜霉病是一種病原體的侵害，可以引發(fā)植物一系列的防御機制，可以識別損傷細胞的信號分子，引發(fā)植物多種信號轉導途徑，最終激活抗脅迫基因的表達［20］。

3.216個線粒體相關基因功能分析

根據(jù)基因在SA誘導的黃瓜PCD中的不同表達情況，推測各基因編碼蛋白的功能分為以下5類：參與線粒體信號轉導（甲酸脫氫酶、氨基丁酸氨基轉移酶、抑制素、脯氨酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶）；參與蛋白質(zhì)合成、折疊和轉運（延伸因子Tu和分子伴侶）；參與線粒體跨膜轉運（線粒體丙酮酸轉運體、解耦聯(lián)蛋白、線粒體肉堿/酰基肉堿載體和亮氨酸拉鏈結構域跨膜蛋白1）；參與線粒體呼吸作用的基因（3-羥基異丁酰CoA水解酶和甘氨酸脫羧酶、雙磷脂酰甘油）；乙酰鳥氨酸轉氨酶目前未發(fā)現(xiàn)關于在植物線粒體中的研究報道。

脯氨酸脫氫酶ProDH基因在SA和霜霉病處理下均為上調(diào)表達，且是隨處理時間延長逐步上調(diào)響應，該基因在依賴SA的HR反應，立枯絲核菌侵染綠豆時，脯氨酸積累［21］。研究發(fā)現(xiàn)其與SA誘導有關，通過降低ROS含量和增加對病原體的敏感性從而降低擬南芥的細胞死亡率［22］。這證實該基因參與SA和霜霉病誘導的信號途徑，對植物的抗病性起重要作用，可能為誘導植物PCD發(fā)生的關鍵基因。

延伸因子Tu和分子伴侶在SA和霜霉病的處理下呈相反的趨勢，說明在植物PCD的過程中，參與蛋白質(zhì)合成折疊和轉運的基因表達呈復雜變化趨勢，可能抑制或促進。延伸因子Tu（EF-Tu）存在于及植物的線粒體細胞內(nèi)，是在mRNA翻譯時促進多肽鏈延伸的蛋白質(zhì)因子。高溫、干旱、低溫以及病原菌侵入等因素可以誘導EF-Tu基因的表達，提高植物的耐熱、耐旱及抗病性。研究發(fā)現(xiàn)在非生物脅迫下，植物體中EF-Tu的表達上調(diào)，表明在脅迫過程中EF-Tu基因有重要作用［23］。在高溫和干旱脅迫下，玉米的EF-Tu合成和積累增加。

線粒體內(nèi)膜轉移酶基因在SA中呈上調(diào)趨勢，而在霜霉病處理下呈下降趨勢。該基因在脅迫處理下可以通過基因的調(diào)控減小植物在脅迫下的損傷，說明研究在植物PCD過程中線粒體跨膜轉運的基因作用有重要意義。線粒體丙酮酸轉運體（MPC）存在于線粒體內(nèi)膜，可以介導丙酮酸由細胞質(zhì)內(nèi)進入線粒體，是其進行三羧酸循環(huán)的重要一步；為脂肪酸、酮類和膽固醇的合成提供醋酸鹽［24］。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下煙草MPC基因通過調(diào)節(jié)ABA的釋放，影響保衛(wèi)細胞跨膜離子轉運及氣孔運動，提高煙草的抗旱性［25］。

3-羥基異丁酰CoA水解酶（HIBCH）和甘氨酸脫羧酶（GLDC），在SA和霜霉病處理下呈相反的趨勢，而雙磷脂酰甘油（CL）基因呈相似的上調(diào)表達趨勢。雙磷脂酰甘油（CL）是一種二聚的磷脂，可以參與線粒體呼吸作用和電子傳遞鏈，與線粒體的功能和結構有關［26］。研究發(fā)現(xiàn)線粒體中的CL基因可以參與細胞氧化磷酸化和細胞凋亡過程［27］。

綜上，被研究的16個基因中線粒體丙酮酸載體2（A）、抑制素3（B）、雙磷脂酰甘油脫酰酶（F）、線粒體肉堿/?；鈮A載體（H）、氨基丁酸氨基轉移酶1（J）、脯氨酸脫氫酶2（L）等6個基因在響應SA和霜霉病處理時都是上調(diào)表達，顯示這些基因在SA誘導的PCD過程中承擔一定的功能；而3-羥基異丁酰CoA水解酶（C）、分子伴侶60N-2（D）、甘氨酸脫羧酶（E）、延伸因子Tu（O）和亮氨酸拉鏈結構域跨膜蛋白1（N）等5個基因在SA處理中為上調(diào)表達，在霜霉病處理中卻是下調(diào)表達，可以推斷這些基因在響應SA時所起的作用與霜霉菌引起的病變關系不密切；另外5個基因解耦聯(lián)蛋白5（G）、甲酸脫氫酶1（I）、線粒體內(nèi)膜轉移酶亞家族（K）、丙酮酸脫氫酶E1α（M）、和乙酰鳥氨酸轉氨酶（P）等雖然響應SA和霜霉菌比較一致，但表達量的上調(diào)幅度很小，難以說明在黃瓜SA誘導的PCD過程中與霜霉菌引起的HR反應中起相似的作用。

4 結論

本文通過qRT-PCR技術分析16個線粒體相關基因的表達動態(tài)，在SA和霜霉病處理均表達，其中11個基因在響應SA和霜霉菌上一致，5個基因不一致。說明SA和霜霉病誘導PCD具有相似性和差異性。16個基因參與線粒體膜轉運、細胞呼吸作用、蛋白質(zhì)合成、折疊和轉運、線粒體信號轉導等過程。證實了在線粒體發(fā)生PCD過程中與這16個基因有密切關系。