張亭 楊璇璇 雷勤 劉娟娟 李繼剛

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北省微生物多樣性與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071002）

棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）是農(nóng)作物的重要害蟲，因其寄主范圍廣、繁殖潛能大、種群能遠(yuǎn)距離遷移和對(duì)環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)等特點(diǎn)，條件適宜時(shí)常大面積爆發(fā)成災(zāi)，造成棉花、玉米、花生、豆類、蔬菜、花卉等的嚴(yán)重?fù)p失，其中以棉花遭受的損失最大，例如1992年在我國(guó)棉區(qū)的棉鈴蟲大爆發(fā)［1］。隨后，在我國(guó)出現(xiàn)了大量的關(guān)于棉鈴蟲殺蟲劑的研究［2-3］。其中，以辛硫磷為代表的有機(jī)磷農(nóng)藥與以滅多威為代表的氨基甲酸酯類殺蟲劑被廣泛應(yīng)用。

乙 酰 膽 堿 酯 酶（Acetylcholinestrase，AchE，EC3.1.1.7）能快速水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（Acetylcholine，Ach）生成膽堿及乙酸，終止神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿對(duì)突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)的正常傳遞［4］。AchE上有有機(jī)磷與氨基甲酸酯類化合物的作用位點(diǎn)，這兩類化合物與AchE結(jié)合后，會(huì)造成酶催化部位的磷酰化與氨基甲?；茐牧苏５纳窠?jīng)傳導(dǎo)作用，生物長(zhǎng)期處于神經(jīng)興奮狀態(tài)，最終死亡［5］。

棉鈴蟲的AchE由ace1和ace2兩種基因編碼，ace1是AchE的主要編碼基因［6］。大量研究表明，昆蟲的抗藥性便與ace基因的過(guò)量表達(dá)有著密切關(guān)系［7-9］，且ace基因在農(nóng)藥壓力的選擇下發(fā)生著進(jìn)化［10］。其中，F(xiàn)ournier 等［11］研究表明，果蠅種類的抗藥性與ace過(guò)量表達(dá)有關(guān)，而在有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類殺蟲劑誘導(dǎo)的棉鈴蟲中，ace1與ace2所發(fā)揮的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

RNA 干 擾（RNA interference，RNAi） 是 指dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后使內(nèi)源的mRNA發(fā)生特異性的降解，從而引起靶基因的沉默，使得其相應(yīng)的功能及表型缺失。自從1998年首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)注射dsRNA能夠引起基因沉默以來(lái)，dsRNA引起的RNA干擾廣泛應(yīng)用于昆蟲學(xué)研究中［12］。2013年，Xiong等［13］喂食表達(dá)HaHR3 dsRNA的菌液或者轉(zhuǎn)基因葉片后，蟲子體內(nèi)HaHR3 mRNA和蛋白水平急劇下降，從而導(dǎo)致發(fā)育畸形及幼蟲致死。喂食dsRNA可以引起昆蟲RNAi，為深入闡明昆蟲抗藥性機(jī)理和害蟲防控提供了新思路。

為此，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)辛硫磷、滅多威誘導(dǎo)和飼喂表達(dá)dsRNA的菌液后，棉鈴蟲幼蟲中ace1和ace2轉(zhuǎn)錄水平的變化，旨為進(jìn)一步研究有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯類殺蟲劑在基因分子水平上對(duì)棉鈴蟲的AchE的作用機(jī)制和以AchE為靶標(biāo)基因的RNAi效應(yīng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx 棉鈴蟲卵購(gòu)買自河南科云生物公司，人工氣候箱進(jìn)行孵化，其幼蟲為有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的敏感品系，孵化的幼蟲采用人工飼料（本實(shí)驗(yàn)提供）飼養(yǎng)，溫度28±2℃，相對(duì)濕度65±5%，光周期16 L∶8 D。成蟲用10%蜂蜜水飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 辛硫磷購(gòu)自Sigma公司；滅多威購(gòu)自Aladdin公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；TRIzon Reagent購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；熒光PCR試劑FastStart Universal SYBR Green Master購(gòu)自Roche公司；IPTG從自寶生物工程（大連）有限公司購(gòu)買；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

本實(shí)驗(yàn)dsRNA的細(xì)菌表達(dá)采用L4440/HT115系統(tǒng)［14］。宿主菌 HT115（DE3 溶原菌）RNase III缺陷，可在IPTG誘導(dǎo)下，高效表達(dá)克隆于含兩個(gè)噬菌體T7啟動(dòng)子的質(zhì)粒上（L4440）的基因的dsRNA［14］。本實(shí)驗(yàn)所用L4440已經(jīng)過(guò)改造，使用Xcm I酶切后，3'端各突出一個(gè)“T”堿基，因此可方便地通過(guò)TA克隆技術(shù)將棉鈴蟲ace1（GenBank 檢索號(hào)DQ001323，取1109 bp的片段）和ace2基因序列（GenBank 檢索號(hào)AF369793，取500 bp的片段）各一個(gè)片段分別構(gòu)建成dsRNA表達(dá)載體。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)處理 殺蟲劑實(shí)驗(yàn)組處理：供試棉鈴蟲飼養(yǎng)至4齡1 d時(shí)，取180條幼蟲分為3組，在滅多威處理組，每頭幼蟲點(diǎn)滴滅多威藥液0.1×7 μL（實(shí)驗(yàn)組一），在辛硫磷處理組，每頭幼蟲點(diǎn)滴辛硫磷藥液0.3×10 μL（實(shí)驗(yàn)組二），處理后的棉鈴蟲單獨(dú)放入玻璃管中，用人工飼料喂養(yǎng)，用清水作為對(duì)照組，之后移入培養(yǎng)箱中，分別在12 h、24 h、30 h、48 h、60 h取樣。重復(fù)3次。

RNAi實(shí)驗(yàn)組處理：將含有雙鏈RNA表達(dá)載體的HT115菌，在含有100 μg/mL Amp LB 培養(yǎng)基中以37℃的溫度和220 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行12 h的震蕩培養(yǎng)。得到的菌液按照1∶100的體積比接種到液體LB培養(yǎng)基中。當(dāng)OD600= 0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.45 mmol/L，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。取新鮮發(fā)酵液，經(jīng)4℃，4000 r/min，離心15 min后棄上清液，加入新的LB制成10倍細(xì)菌濃縮液。將新鮮的飼料與100 μL濃縮細(xì)菌液攪拌均勻后備用。取180只二齡的棉鈴蟲，分為A、B、C三組，A組飼喂含有空菌的飼料，B組飼喂含有能夠表達(dá)ace1基因dsRNA菌液的飼料，C組飼喂能夠表達(dá)ace2基因dsRNA菌液的飼料。所有棉鈴蟲都放置在人工氣候箱內(nèi)給予相同的生長(zhǎng)環(huán)境。在飼喂的過(guò)程中每24 h更換加入菌液的飼料，取樣并拍照觀察幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育狀況。本實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 棉鈴蟲總RNA的提取及cDNA的制備 按照TRIzon Reagent試劑盒說(shuō)明書方法，分別提取試驗(yàn)組和對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)幼蟲的總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的不同樣不同時(shí)間點(diǎn)的RNA分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA，備用。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 采用Beacon Designer 8軟件，按照Real-time PCR要求設(shè)計(jì)ribosomal protein S3a（RPS3A） 內(nèi) 參 基 因 和 ace1、ace2基因的引物（表1）。以合成的cDNA為模板，采用LigtCycler?PCR QC Kit試劑盒對(duì)各基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，95℃變性12 s，60℃退火40 s，72℃延伸12 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 用LightCycler?96熒光PCR儀（Roche）所帶的 LightCycler?96 SW 1.1 軟件中讀取數(shù)據(jù)，使用2-△△Ct的方法［15］分析數(shù)據(jù)，使用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism 5軟件制作圖表。

2 結(jié)果

2.1 殺蟲劑處理后棉鈴蟲ace基因表達(dá)規(guī)律

采用RT-qPCR對(duì)殺蟲劑處理后的乙酰膽堿酯酶基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因和內(nèi)參基因的引物

結(jié)果（圖1）顯示：滅多威處理后ace1基因表達(dá)量在12 h、24 h、48 h、60 h為顯著下調(diào)。辛硫磷處理后ace1基因表達(dá)量在12 h、24 h、48 h顯著下調(diào)，在60 h上調(diào)。從整體趨勢(shì)上分析，滅多威處理后ace1基因表達(dá)量的變化是下調(diào)，辛硫磷處理后棉鈴蟲ace1基因表達(dá)量的變化是先下調(diào)后上調(diào)。

圖1 殺蟲劑處理后棉鈴蟲ace1基因表達(dá)規(guī)律

滅多威處理后ace2基因表達(dá)量在12 h顯著下調(diào)，在24 h、36 h、60 h顯著上調(diào)。辛硫磷處理后ace2基因表達(dá)量在12 h、24 h顯著下調(diào)，在48 h、60 h顯著上調(diào)。從整體趨勢(shì)上分析，滅多威處理后棉鈴蟲ace2基因表達(dá)量的變化是先下調(diào)后上調(diào)，辛硫磷處理后ace2基因表達(dá)量的變化是先下調(diào)后上調(diào)（圖 2）。

2.2 殺蟲劑處理后棉鈴蟲的形態(tài)變化

取四齡的棉鈴蟲分為3組，A組為清水對(duì)照組，B組為滅多威處理組，C組為辛硫磷處理組。在殺蟲劑處理后12 h、24 h和36 h皆出現(xiàn)棉鈴蟲嚴(yán)重蜷縮的現(xiàn)象。同時(shí)與A組相比，B組和C組化蛹更早，但從蛹到蛾的時(shí)間更長(zhǎng)，羽化的失敗率更高，且出現(xiàn)多種形態(tài)的畸形（圖3）。

圖2 殺蟲劑處理后棉鈴蟲ace2基因表達(dá)規(guī)律

圖3 殺蟲劑處理前后棉鈴蟲表型變化

2.3 喂食表達(dá)dsRNA的細(xì)菌液后棉鈴蟲ace基因表達(dá)規(guī)律

對(duì)棉鈴蟲喂食表達(dá)ace1基因dsRNA的細(xì)菌液后，棉鈴蟲ace1基因表達(dá)量在24 h、48 h下調(diào)明顯，在72 h、96 h有不明顯上調(diào)（圖4）。對(duì)棉鈴蟲喂食表達(dá)ace2基因dsRNA的細(xì)菌液后，棉鈴蟲ace2基因表達(dá)量在24 h、48 h下調(diào)明顯，在72 h出現(xiàn)上調(diào)，在96 h下調(diào)（圖5）。從整體趨勢(shì)上分析，在對(duì)棉鈴蟲進(jìn)行ace基因dsRNA處理后，ace基因表達(dá)量變化下調(diào)。

2.4 喂食表達(dá)dsRNA的細(xì)菌液后棉鈴蟲的形態(tài)變化

圖4 飼喂表達(dá)ace1基因dsRNA細(xì)菌液后，棉鈴蟲ace1基因的表達(dá)規(guī)律

圖5 飼喂表達(dá)ace2基因dsRNA細(xì)菌液后，棉鈴蟲ace2基因的表達(dá)規(guī)律

A組喂食空菌，B組喂食表達(dá)ace1基因dsRNA細(xì)菌液，C組喂食表達(dá)ace2基因dsRNA細(xì)菌液。喂食第2天后發(fā)現(xiàn)（圖6），與A組比較，B組和C組的棉鈴蟲在死亡的同時(shí)其成長(zhǎng)也出現(xiàn)滯后現(xiàn)象。喂食第4天后發(fā)現(xiàn)，A組的棉鈴蟲大小與體重差別細(xì)微，而B組和C組的棉鈴蟲在死亡的同時(shí)其大小和體重有了很大的差別。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，辛硫磷和滅多威進(jìn)行誘導(dǎo)后，棉鈴蟲在12 h時(shí)，ace1和ace2皆顯著下調(diào)，這可能是棉鈴蟲幼蟲生理代謝水平被破壞導(dǎo)致的。辛硫磷誘導(dǎo)48 h時(shí)，ace1顯著下調(diào)；ace2顯著上調(diào)。滅多威誘導(dǎo)；24 h、48 h、60 h，ace1顯著下調(diào)；24 h、36 h、60 h，ace2顯著上調(diào)。總體來(lái)看，當(dāng)農(nóng)藥處理滿足一定的時(shí)間后，ace1表達(dá)量降低的時(shí)候ace2的表達(dá)量增加，推測(cè)棉鈴蟲的成活與ace2的過(guò)量表達(dá)有關(guān)。

圖6 飼喂表達(dá)ace基因dsRNA的細(xì)菌液后，棉鈴蟲的表型變化

大量研究結(jié)果表明，ace1是AchE的主要的編碼基因［16-19］，而在有些昆蟲中ace2比ace1更豐富，AchE2是AchE的主要酶型［20-21］。經(jīng)過(guò)辛硫磷與滅多威誘導(dǎo)后，從整體水平上分析，ace1基因表達(dá)量仍比ace2基因表達(dá)量多，從ace基因表達(dá)量的變化來(lái)說(shuō)，與對(duì)照組相比，ace1基因表達(dá)量減少，ace2基因表達(dá)量增加。從上可推測(cè)，兩種農(nóng)藥誘導(dǎo)棉鈴蟲后，AchE1仍是AchE的主要酶型，在AchE1的含量不足以支撐棉鈴蟲的正常生理活性后，AchE2的酶活力增加以滿足棉鈴蟲的生理需求。

對(duì)棉鈴蟲進(jìn)行ace基因dsRNA處理后，棉鈴蟲在死亡的同時(shí)也出現(xiàn)了不同程度的生長(zhǎng)滯后現(xiàn)象。通過(guò)RT-qPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)ace基因表達(dá)量受到抑制，這說(shuō)明ace基因可以作為研究RNAi技術(shù)防治棉鈴蟲的靶基因。但是ace1基因和ace2基因在后面的時(shí)間點(diǎn)里出現(xiàn)了上調(diào)的現(xiàn)象，推測(cè)棉鈴蟲被喂食表達(dá)dsRNA菌液的飼料后，體內(nèi)mRNA被降解，棉鈴蟲在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)環(huán)境，其體內(nèi)的ace基因過(guò)量表達(dá)來(lái)彌補(bǔ)被降解的mRNA。因此，在使用ace基因作為RNAi技術(shù)靶基因的時(shí)候，要慎重考慮棉鈴蟲的抗性問(wèn)題。鑒于植物介導(dǎo)的昆蟲RNAi已經(jīng)成為害蟲防治基因過(guò)程的一個(gè)重要思路［22-23］，本研究可為在基因水平上研究有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯類殺蟲劑對(duì)棉鈴蟲的ace基因的作用機(jī)制、以及以ace基因?yàn)榘袠?biāo)的抗蟲研究提供參考。

4 結(jié)論

通過(guò)辛硫磷、滅多威誘導(dǎo)、dsRNA表達(dá)菌處理棉鈴蟲幼蟲，可以造成ace1和ace2轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化。用滅多威、辛硫磷處理后，ace1和ace2表達(dá)水平先出現(xiàn)顯著下調(diào)，其后，ace1繼續(xù)下調(diào)而ace2上調(diào)；通過(guò)飼喂dsRNA表達(dá)菌進(jìn)行RNAi處理，可使棉鈴蟲ace1、ace2基因表達(dá)量明顯下調(diào)（24 h、48 h），從而抑制靶標(biāo)基因表達(dá)。