趙小強(qiáng) 陳志榮 何芳 沈楠 高峰 黃家風(fēng)

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）是一種土壤傳播的植物病原真菌，通過(guò)根部侵染宿主微管組織，引發(fā)植物黃萎病［1］。其寄主范圍廣泛，可危害400多種經(jīng)濟(jì)作物，已成為嚴(yán)重影響棉花、茄子、馬鈴薯、向日葵等作物生產(chǎn)的重要病原之一［2-3］。

大麗輪枝菌因其分生孢子便于收集，以分生孢子作為轉(zhuǎn)化材料在功能基因組的研究中取得了很大的進(jìn)展，如致病性相關(guān)基因VMK1和VGB［4-5］，與微菌核生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因VDH1、VdPKAC1和VdPR3［6-8］，以及效應(yīng)子蛋白基因VdSCP7和LysM的功能鑒定［9-10］，均以分生孢子作為遺傳轉(zhuǎn)化材料通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法完成的。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)以其操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定和插入位點(diǎn)無(wú)序列特異性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于絲狀真菌的功能基因的遺傳操作。但對(duì)于一些特殊基因，如真菌細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的鑒定，則需要以原生質(zhì)體作為研究材料，通過(guò)再生細(xì)胞壁的過(guò)程進(jìn)行鑒定［11］，但是目前可供參考的有關(guān)大麗輪枝菌原生質(zhì)體制備及再生體系的研究報(bào)道還很缺乏。

原生質(zhì)體是去掉細(xì)胞壁的活體細(xì)胞，它既可以作為一個(gè)單細(xì)胞系統(tǒng)來(lái)研究細(xì)胞分裂與分化、細(xì)胞器涉入、細(xì)胞壁再生、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、病毒侵染機(jī)理、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等基礎(chǔ)理論，又能通過(guò)破碎細(xì)胞膜分離出大量完整的細(xì)胞器如線粒體、核糖體等，為細(xì)胞器的功能、結(jié)構(gòu)、生理生化研究奠定基礎(chǔ)［12-13］。原生質(zhì)體作為重要的遺傳轉(zhuǎn)化材料通過(guò)PEG-CaCl2轉(zhuǎn)化在植物病原絲狀真菌稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和刺盤孢菌（Colletotrichum spp.）的功能基因組研究中也得到廣泛應(yīng)用［14］。由于不同種類的真菌及同一種真菌處于不同菌齡，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、組成及代謝組分存在差異［15］，因此在真菌原生質(zhì)體的制備過(guò)程中，溫度、時(shí)間、酶濃度、滲透壓穩(wěn)定劑和pH等都會(huì)影響酶促反應(yīng)，造成原生質(zhì)體制備條件存在差異［16］。雖然原生質(zhì)體的制備過(guò)程比較簡(jiǎn)單，但獲得濃度較高、活性較高的原生質(zhì)體比較困難。本研究針對(duì)大麗輪枝菌原生質(zhì)體的制備，對(duì)菌齡、酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑等影響因素進(jìn)行了優(yōu)化；針對(duì)原生質(zhì)體再生，對(duì)培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基中的Agar濃度及菌絲酶解時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化；并對(duì)優(yōu)化條件下獲得的原生質(zhì)體進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)GFP瞬時(shí)表達(dá)，對(duì)原生質(zhì)體的活性和轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了確定，旨在建立原生質(zhì)體的制備和再生體系，為大麗輪枝菌的遺傳轉(zhuǎn)化及功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）落葉型強(qiáng)致病力菌株V592，由本實(shí)驗(yàn)室從棉花上分離、鑒定并保存；含GFP基因的重組質(zhì)粒p1300-Trpc-HPT-PoliC-GFP-Nubter，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 裂解酶（Lysing enzyme）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，用滲透壓穩(wěn)定劑溶解配置，0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾滅菌。Miracloth濾布（22-25 μm，）購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司。

TB3培養(yǎng)基：Yeast extract 3 g，casamino acid 3 g，sucrose 200 g，agar 7 g定容至1 L；SR培養(yǎng)基：Yeast extract 1 g，Enzymatic casein hydrolysate 1 g，Sucrose 342 g，Agar 15 g，定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌絲搖培時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響 將1 mL濃度為1×108個(gè)/mL的分生孢子加入100 mL YEPD 中［17］，于 26℃，200 r/min分別搖培 12、14、16、18和20 h收集菌絲，先用單層滅菌的Mirocloth濾布過(guò)濾菌液，再分別用100 mL無(wú)菌水和30 mL 1.2 mol/L的KCl沖洗菌絲；用鑷子輕輕夾取菌絲，稱取0.5 g放入50 mL的三角瓶中，加入10 mL濃度為5 mg/mL的酶解液，28℃、150 r/min酶解3 h；再用2層滅菌的Mirocloth濾布過(guò)濾收集原生質(zhì)體。每個(gè)搖培時(shí)間設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取樣3次，利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體數(shù)量，以確定最佳的搖培時(shí)間。

1.2.2 酶濃度對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響 按照上述已確定的最佳搖培時(shí)間培養(yǎng)分生孢子并收集菌絲，然后在菌絲中分別加入不同濃度的酶解液，28℃、150 r/min酶解3 h。酶解液濃度梯度設(shè)置為1、2.5、5、10、20和25 mg/mL。酶解完成后，過(guò)濾收集原生質(zhì)體。每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取樣3次，利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體個(gè)數(shù)，以確定最佳的酶濃度。

1.2.3 酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響 以上述最佳搖培時(shí)間培養(yǎng)分生孢子并收集菌絲，然后加入上述確定的最佳濃度的酶解液，分別在不同溫度下150 r/min酶解3 h，過(guò)濾收集原生質(zhì)體并計(jì)數(shù)，以確定最佳的酶解溫度。溫度梯度設(shè)置為 24、26、28、30、32 和 34℃［16，18］，每個(gè)溫度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取樣3次，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體個(gè)數(shù)。

以上述最佳搖培時(shí)間培養(yǎng)分生孢子并收集菌絲，再以上述確定的最佳酶濃度和最適溫度將菌絲分別酶解2、3、4、5、6、7和 8 h，然后過(guò)濾收集原生質(zhì)體并計(jì)數(shù)，以確定最佳的酶解時(shí)間。每個(gè)酶解時(shí)間設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取樣3次，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體個(gè)數(shù)。

1.2.4 滲透壓穩(wěn)定劑及濃度對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響 本實(shí)驗(yàn)所用滲透壓穩(wěn)定劑為原生質(zhì)體制備中常用的 7種穩(wěn)定劑（NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和山梨醇），最初的濃度設(shè)定為0.6 mol/L［19-24］。以上述最佳搖培時(shí)間培養(yǎng)分生孢子并收集菌絲，先用100 mL無(wú)菌水沖洗菌絲，再分別用30 mL上述7種滲透壓穩(wěn)定劑沖洗菌絲；然后分別用7種滲透壓穩(wěn)定劑配置的酶解液（10 mg/mL）在上述優(yōu)化的酶解條件下酶解菌絲體，再按照前面的方法收集原生質(zhì)體并計(jì)數(shù)。

KCl和NaCl最適濃度的確定。KCl的濃度分別設(shè) 置 為 0.4、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2和 1.4 mol/L；NaCl的濃度分別設(shè)置為 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0和1.2 mol/L。其他條件不變，按照上述方法制備原生質(zhì)體并計(jì)數(shù)。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取樣3次。

1.2.5 pH對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響 將上述確定的滲透壓穩(wěn)定分別設(shè)置7個(gè)不同的pH條件，以上述明確的最佳搖培時(shí)間、酶濃度、酶解溫度和酶解時(shí)間制備原生質(zhì)體，以確定最適的pH值。pH分別設(shè)置為3、4、5、6、7、8、9；每個(gè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取樣3次原生質(zhì)體個(gè)數(shù)。

1.2.6 再生培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體再生的影響 選擇3種培養(yǎng)基 PDA、TB3、SR［17，25］，采用雙層覆蓋法［18，23］對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行再生培養(yǎng)。吸取 0.1 mL濃度為1.0 × 102個(gè)/mL的原生質(zhì)體懸液分別均勻涂布在Agar濃度1.5%的上述3種培養(yǎng)基平板上，再向其中分別倒入溫度低于55℃的Agar濃度為1%的同樣的培養(yǎng)基，搖勻覆蓋。待上層培養(yǎng)基凝固后置于26℃黑暗培養(yǎng) 60-80 h，取出統(tǒng)計(jì)再生菌落數(shù)并計(jì)算原生質(zhì)體的再生率。同時(shí)將對(duì)照組原生質(zhì)體用無(wú)菌雙蒸水低滲裂解 15 min，以同樣方法均勻涂布并倒入再生培養(yǎng)基，以消除非原生質(zhì)體形成的菌落所產(chǎn)生的誤差。每種培養(yǎng)基設(shè) 3個(gè)重復(fù)。原生質(zhì)體再生率的計(jì)算公式如下：

再生率（%）=（原生質(zhì)體再生菌落數(shù)-對(duì)照組再生菌落數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)）×100%

1.2.7 Agar濃度對(duì)原生質(zhì)體再生的影響 選定合適的再生培養(yǎng)基后，設(shè)置7個(gè)Agar濃度（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%和1.0%），按照上述描述的雙層覆蓋法對(duì)上層覆蓋培養(yǎng)基中的Agar濃度進(jìn)行選擇。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)再生菌落數(shù)，并計(jì)算原生質(zhì)體的再生率。

1.2.8 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體再生的影響 將菌絲體分別酶解2、3、4、5、6、7和 8 h，然后將收集的原生質(zhì)體稀釋到 1.0 × 102個(gè)/mL，按上述描述的雙層覆蓋法在選定的再生培養(yǎng)基上及最佳的Agar覆蓋濃度中26℃下暗培養(yǎng) 60-80 h，統(tǒng)計(jì)再生菌落數(shù)，并計(jì)算原生質(zhì)體的再生率，以確定適宜原生質(zhì)體再生的最適酶解時(shí)間。每個(gè)酶解時(shí)間設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.9 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 將-80℃保存的原生質(zhì)體取出于冰上解凍10 min或?qū)傊苽涞脑|(zhì)體置于冰上，加入1-2 μg質(zhì)粒輕輕混勻，對(duì)照加入相應(yīng)體積的1×STC輕輕混勻，于冰上靜置20 min。按照每管2 mL的量，逐滴加入1×PTC，滴完后冰上靜置20 min。然后將25 mL預(yù)冷的1×STC緩慢倒入離心管中，4000 r/min，4℃離心15 min，去上清；再加入3 mL 溫度低于55℃的再生培養(yǎng)基，混勻后置于26℃恒溫箱中黑暗放置12-13 h進(jìn)行細(xì)胞壁再生［17］。1.2.10 計(jì)數(shù)及數(shù)據(jù)分析工具 光學(xué)顯微鏡下原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)為10個(gè)視野中統(tǒng)計(jì)的平均數(shù)，每個(gè)樣品為3個(gè)重復(fù)；采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、用origin 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖片制作。

2 結(jié)果

2.1 原生質(zhì)體的制備

2.1.1 搖培時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響 將分生孢子分別搖培不同時(shí)間收集菌絲，搖培時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體釋放量的影響如圖1-A所示，從12 h開始，原生質(zhì)體的釋放量隨著搖培時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，18 h時(shí)釋放量達(dá)到最大，20 h開始急劇下降；搖培18 h時(shí)原生質(zhì)體釋放量分別是16 h的4.1倍，是20 h的3.7倍，說(shuō)明分生孢子搖培18 h是菌絲體釋放原生質(zhì)體的最佳搖培時(shí)間。

2.1.2 酶濃度對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響 為了確定裂解酶濃度和底物菌絲量之間的關(guān)系，將分生孢子搖培18 h收集菌絲，用不同濃度的裂解酶酶解4 h，統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的釋放量。如圖1-B所示，隨著酶濃度的升高，原生質(zhì)體的釋放量隨之增加，當(dāng)酶濃度為10 mg/mL和20 mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體的釋放量無(wú)明顯差異，均達(dá)到最大值，分別為2.05×107個(gè)/mL和2.04×107個(gè)/mL，是酶濃度為5 mg/mL的1.6倍，酶濃度為25 mg/mL的1.5倍，表明10-20 mg/mL的酶濃度是酶解菌絲釋放原生質(zhì)體的最適酶濃度。

圖1 菌齡和酶濃度對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響

2.1.3 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響 在一定溫度范圍內(nèi)，提高酶解溫度，有利于加速酶促反應(yīng)。收集搖培18 h的菌絲，以10 mg/mL的酶濃度酶解4 h，比較不同酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響。由圖2-A看出，酶解溫度30℃時(shí)，原生質(zhì)體的釋放量最大，但當(dāng)超過(guò)32℃時(shí)，原生質(zhì)體的量急劇下降，表明30℃的酶解溫度最有利于原生質(zhì)體的釋放。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響 在上述確定的最適條件下，即收集培養(yǎng)18 h的菌絲，加入10 mg/mL的裂解酶，在酶解溫度為30℃的情況下對(duì)酶解時(shí)間進(jìn)行確定。結(jié)果如圖2-B所示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體的釋放量逐漸增加，酶解4-5 h時(shí)達(dá)到最大，分別為3.29×107個(gè)/mL和3.27×107個(gè)/mL，是酶解3 h的2倍，是酶解6 h的1.2倍。表明酶解4-5 h是菌絲體釋放原生質(zhì)體的最適酶解時(shí)間，且酶解時(shí)間明顯影響原生質(zhì)體的釋放，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都不利于原生質(zhì)體的釋放。

圖2 酶解溫度和時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響

2.1.5 滲透壓穩(wěn)定劑及濃度對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響 在上述確定的最適條件下，對(duì)原生質(zhì)體制備中常用的7種滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行篩選，先以0.6 mol/L的常規(guī)濃度對(duì)7種穩(wěn)定劑進(jìn)行初步篩選，結(jié)果如圖3-A所示，KCl和NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體的釋放作用最強(qiáng)；山梨醇次之；MgSO4、甘露醇、葡萄糖和蔗糖對(duì)原生質(zhì)體的釋放幾乎不起作用。因此，KCl和NaCl均可作為大麗輪枝菌原生質(zhì)體制備過(guò)程中的滲透壓穩(wěn)定劑。為了確定滲透壓穩(wěn)定劑的濃度對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響，對(duì)KCl和NaCl發(fā)揮作用的最適濃度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖3-B和3-C所示，1.2 mol/L的KCl或0.7 mol/L的NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體的釋放效果最佳。

圖3 滲透壓穩(wěn)定劑及濃度對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響

2.1.6 pH對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響 緩沖體系的 pH值是影響酶活的一個(gè)主要因素。在上述確定的最適條件下，即收集培養(yǎng)18 h的菌絲，加入10 mg/mL的裂解酶，30℃酶解4 h，以1.2 mol/L的 KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，比較不同pH條件下原生質(zhì)體釋放情況。結(jié)果如圖4-A表明，當(dāng)pH為6.0時(shí)，原生質(zhì)體的釋放量最大，每毫升酶液釋放的原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)3.3×107個(gè)/mL，在其他pH條件下，原生質(zhì)體的釋放量都比較少。此時(shí)通過(guò)顯微觀察，菌絲裂解后釋放出密集的原生質(zhì)體，原生質(zhì)體多數(shù)為規(guī)則的圓球形，大小不一，質(zhì)膜完整（圖4-B）。

圖4 pH對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響及原生質(zhì)體形態(tài)觀察

2.2 原生質(zhì)體的再生

2.2.1 再生培養(yǎng)基及濃度對(duì)原生質(zhì)體再生的影響 采用雙層覆蓋法，對(duì)PDA、TB3和SR 3種培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體再生情況進(jìn)行了比較，結(jié)果（圖5-A）顯示，原生質(zhì)體在TB3、SR和PDA上的再生率分別為19.72%、18.56%和13.41%，表明TB3和SR作為再生培養(yǎng)基，其作用明顯優(yōu)于PDA培養(yǎng)基。

以TB3作為再生培養(yǎng)基，對(duì)不同Agar濃度的覆蓋培養(yǎng)基進(jìn)行比較，結(jié)果（圖5-B）顯示，Agar濃度為0.5%時(shí)，原生質(zhì)體的再生率最高，達(dá)到22%；隨著Agar濃度的增大，原生質(zhì)體再生率隨之降低，當(dāng)Agar濃度高于1.0%時(shí)，原生質(zhì)體再生率低于2%；由于Agar濃度低于0.5%時(shí)，培養(yǎng)基不易凝固，因此適于原生質(zhì)體再生的上層覆蓋培養(yǎng)基的Agar濃度為0.5%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙層覆蓋法中上層覆蓋培養(yǎng)基的濃度對(duì)原生質(zhì)體的再生具有明顯的影響。

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體再生的影響 菌絲體的酶解時(shí)間明顯影響原生質(zhì)體的釋放量，當(dāng)菌絲體酶解4-5 h時(shí)原生質(zhì)體的釋放量最大（圖5-C）。為了明確酶解時(shí)間是否影響原生質(zhì)體的再生，在上述明確的最佳條件下，確定酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體再生的影響。結(jié)果表明，將菌絲體酶解4 h，原生質(zhì)體再生率最高，達(dá)到22.45%；菌絲體酶解5 h時(shí)，再生率開始下降；當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)到7 h時(shí)，原生質(zhì)體再生率僅為5.28%，由此說(shuō)明酶解時(shí)間也影響原生質(zhì)體的再生。綜合考慮原生質(zhì)體的釋放和再生，菌絲體的最適酶解時(shí)間是4 h。

2.3 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

為了直觀地觀察以上制備的原生質(zhì)體是否可以用于轉(zhuǎn)化，將構(gòu)建好的含GFP基因的重組質(zhì)粒p1300-Trpc-HPT-PoliC-GFP-Nubter通 過(guò)PEG-CaCl2介導(dǎo)對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。藍(lán)色激發(fā)光下，未經(jīng)載體轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體沒(méi)有觀察到綠色熒光，而經(jīng)過(guò)載體轉(zhuǎn)化的3個(gè)重復(fù)都有明顯的綠色熒光，且原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)完整，呈綠色小球型。并且經(jīng)過(guò)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體與未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對(duì)照一樣，通過(guò)細(xì)胞壁再生都能萌發(fā)形成菌絲體（圖6），表明本研究所制備的原生質(zhì)體具有活性，可用于遺傳轉(zhuǎn)化。由于本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒只能在真核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)GFP，因此當(dāng)原生質(zhì)體再生分化出菌絲體以后GFP綠色熒光逐漸減弱直至消失。

3 討論

雖然大麗輪枝菌的功能研究通常以分生孢子作為重要的遺傳轉(zhuǎn)化材料，但對(duì)于一些特殊基因的功能鑒定仍然需要對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。由于原生質(zhì)體的優(yōu)劣直接影響轉(zhuǎn)化效率，因此獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體和再生體系對(duì)研究大麗輪枝菌非常重要。對(duì)于不同種類的真菌來(lái)講，菌齡是影響原生質(zhì)體制備的一個(gè)關(guān)鍵因素。甘藍(lán)枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans）搖培菌絲的時(shí)間為36 h時(shí)原生質(zhì)體釋放量達(dá)到最高［25］，黑曲霉（Aspergillus niger）在培養(yǎng)4 d時(shí)釋放的原生質(zhì)體的量最多［26］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌分生孢子搖培時(shí)間少于18 h，由于分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲量較少，所以影響菌絲體的收集及原生質(zhì)體的釋放；當(dāng)分生孢子搖培18 h時(shí)，此階段由于分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲量較多，且處于生長(zhǎng)旺盛期，所以更適合原生質(zhì)體的制備；繼續(xù)延長(zhǎng)搖培時(shí)間，由于菌絲體分化產(chǎn)生了更多的分生孢子，也不利于原生質(zhì)體的制備，因此獲得更多新鮮的菌絲體對(duì)制備原生體非常重要。

圖5 再生培養(yǎng)基、濃度和酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體再生的影響

圖6 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化GFP的觀察（×400）

由于不同種類真菌其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及組分不同，所需裂解酶濃度和酶解時(shí)間差異較大。弭寶彬?qū)χ苽浼怄哏牭毒苯穼；停‵usedum oxysporum f.sp.capsicum）原生質(zhì)體的條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶濃度為15 mg/mL時(shí)原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，張麗霞等［27］發(fā)現(xiàn)使用2 mg/mL 溶壁酶酶解豬苓菌絲得到原生質(zhì)體的效果較好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，20 mg/mL的酶和10 mg/mL的都能較好地釋放原生質(zhì)體，結(jié)合后面再生率的實(shí)驗(yàn)，表明10 mg/mL的酶液濃度為原生質(zhì)體釋放和再生的體系。酶解過(guò)程中，在一定范圍內(nèi)，裂解酶濃度越高，原生質(zhì)體的產(chǎn)量也越大，但是當(dāng)酶的濃度超過(guò)一定值后，原生質(zhì)體的產(chǎn)量反而下降，甚至急劇下降，這是因?yàn)榱呀饷钢衅渌s酶，如氧化物酶和核糖核酸酶，對(duì)原生質(zhì)體造成破壞所致［16］，另外，酶濃度過(guò)大，原生質(zhì)體脫壁太徹底，對(duì)原生質(zhì)體再生也會(huì)造成嚴(yán)重影響［15］，同樣酶解時(shí)間過(guò)短，菌絲體裂解不充分，影響原生質(zhì)體的釋放；酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成質(zhì)膜破壞，出現(xiàn)破裂不完整的原生質(zhì)體，影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量、質(zhì)量以及原生質(zhì)體的再生。有研究報(bào)道，用Lysing enzyme和Driselase的混合酶對(duì)裂解大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）細(xì)胞壁制備原生質(zhì)體具有明顯的增效作用［28］。姚婷婷等報(bào)道使用1%蝸牛酶+1%纖維素酶+0.1%溶菌酶對(duì)黑曲霉原生質(zhì)體的釋放有較好的作用［29］。本研究使用的裂解酶是Lysing enzyme，該酶含有降解真菌細(xì)胞壁所需的主要酶活成分，如纖維素酶，幾丁質(zhì)酶及蛋白酶等、這種酶與其他的酶系統(tǒng)混合使用對(duì)原生質(zhì)體的制備是否有增效作用還有待進(jìn)一步研究。

滲透壓穩(wěn)定劑既是維持原生質(zhì)體內(nèi)外滲透壓穩(wěn)定的關(guān)鍵因素，更是發(fā)揮酶活性的最佳的場(chǎng)所，因此使用不同的滲透壓穩(wěn)定劑，收獲的原生質(zhì)體量明顯不同。常用滲透壓穩(wěn)定劑有無(wú)機(jī)鹽離子和有機(jī)類化合物兩大類。祝子坪發(fā)現(xiàn)以蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑的產(chǎn)量遠(yuǎn)高于用其他滲透壓穩(wěn)定劑的產(chǎn)量［22］。姚婷婷［29］發(fā)現(xiàn)，山梨醇是黑曲霉釋放原生質(zhì)體最佳的滲透壓穩(wěn)定劑。而本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)機(jī)鹽類的KCl和NaCl是制備大麗輪枝菌原生質(zhì)體的最佳滲透壓穩(wěn)定劑，而蔗糖、葡萄糖等有機(jī)化合物類物質(zhì)不易作為大麗輪枝菌原生質(zhì)體制備的滲透壓穩(wěn)定劑。

李伶俐［25］對(duì)甘藍(lán)枯萎病菌原生質(zhì)體再生的研究結(jié)果表明，SR比PDA更有利于甘藍(lán)枯萎菌原生質(zhì)體的再生，再生率可達(dá)21.13%。本研究對(duì)大麗輪枝菌原生質(zhì)體再生的研究也得到同樣的結(jié)果，TB3和SR作為再生培養(yǎng)基，其作用明顯優(yōu)于PDA培養(yǎng)基，上層覆蓋培養(yǎng)基的Agar濃度為0.5%，再生率最高，達(dá)到22.45%，說(shuō)明再生培養(yǎng)基種類及濃度影響原生質(zhì)體的再生。

將含GFP基因的重組質(zhì)粒對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示，GFP能夠在原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)，說(shuō)明本研究建立的原生質(zhì)體制備和再生體系可用于大麗輪枝菌的遺傳轉(zhuǎn)化，為進(jìn)一步研究大麗輪枝菌功能基因奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將各種主要限制因素進(jìn)行了優(yōu)化，最后確定適于制備大麗輪枝菌原生質(zhì)體的體系為：分生孢子培養(yǎng)18 h收集菌絲，用10 mg/mL的裂解酶于30℃酶解4 h，滲透壓穩(wěn)定劑選用1.2 mol/L 的KCl，pH調(diào)至6，可以獲得3.3×107個(gè)/mL的原生質(zhì)體；原生質(zhì)體再生以TB3作為再生培養(yǎng)基，上層覆蓋培養(yǎng)基Agar的濃度為0.5%，再生率可達(dá)22.45%。