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        富血小板血漿對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型基質(zhì)金屬蛋白酶-9的影響

        2018-08-18 07:50:24劉艷西湖北科技學(xué)院湖北咸寧437100湖北科技學(xué)院第一附屬醫(yī)院咸寧市中心醫(yī)院湖北咸寧437100
        吉林醫(yī)學(xué) 2018年8期
        關(guān)鍵詞:滑膜陽(yáng)性細(xì)胞軟骨

        趙 泉,劉艷西,吳 劍 (1.湖北科技學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院第一附屬醫(yī)院,咸寧市中心醫(yī)院,湖北 咸寧 437100)

        骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis OA)的致病機(jī)理尚未完全明了,但有關(guān)軟骨基質(zhì)的降解已得到共識(shí),目前認(rèn)為與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)有關(guān)。它能夠特異性的裂解軟骨基質(zhì)中的膠原分子,破壞軟骨基質(zhì)的膠原網(wǎng)絡(luò),使軟骨細(xì)胞暴露于炎性因子的攻擊下進(jìn)而出現(xiàn)凋亡[1]。富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)應(yīng)用于臨床和基礎(chǔ)的研究越來(lái)越多,其對(duì)多種類型細(xì)胞損傷的治療作用良好,有實(shí)驗(yàn)研究表明PRP對(duì)軟組織損傷的愈合、韌帶和骨/軟骨的再生、炎性反應(yīng)的消退有促進(jìn)作用[2-3]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)PRP可降低骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中IL-1β[4]含量。然而,PRP在退行性炎性反應(yīng)的軟骨細(xì)胞中的作用仍不清楚。本文通過(guò)觀察富血小板血漿對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型MMP-9的影響,探討其關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用機(jī)理。

        1 材料與方法

        1.1 主要儀器和試劑:注射用青霉素(生產(chǎn)商:華北制藥股份有限公司);氯胺酮注射液(生產(chǎn)商:福建古田藥業(yè)有限公司)。MMP-9檢測(cè)試劑盒(生產(chǎn)商:武漢博士得生物有限公司),MMP-9抗體、山羊抗兔HRP二抗(生產(chǎn)商:上海碧云天生物有限公司),Olympus光學(xué)顯微鏡(生產(chǎn)商:日本奧林巴斯公司);RM2315切片機(jī)(生產(chǎn)商:德國(guó)Leica公司);透射電子顯微鏡(生產(chǎn)商:日本日立公司)。

        1.2 富血小板血漿的制備:整個(gè)制備過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作,使用10 ml帶19號(hào)針頭無(wú)菌注射器抽取1 ml 10%枸櫞酸鈉潤(rùn)管行新西蘭大白兔(萬(wàn)千佳和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,合格證號(hào):0001647)耳緣靜脈穿刺,抽取血液至10 ml。將血液分別放入15 ml離心管,按Aghaloo法提取富血小板血漿[5],即第1次離心215×g 10 min,取離心后白膜層以上血漿置于另一離心管,進(jìn)行第2次離心,條件為863×g 10 min,收集上清即貧血小板血漿,移至另一離心管中,剩余0.8 ml吹打均勻即富血小板血漿[(1 958.33±316.41)×109/L],-80℃冰箱分裝保存?zhèn)溆?,每只兔可提取富血小板血漿(9.6±0.4)ml。

        1.3 動(dòng)物及分組:36只4~5個(gè)月齡新西蘭大白兔(武漢市萬(wàn)千佳禾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司,合格證號(hào):0001647),體重2.5~3.0 kg,雄雌各半。隨機(jī)將36只大白兔分為對(duì)照組、模型組和PRP組(n=12)。按10 mg/kg氯胺酮麻醉后,模型組、PRP組左膝關(guān)節(jié)行改良Hulth術(shù)造模,即行膝內(nèi)側(cè)4 cm的縱行切口,探查膝關(guān)節(jié)無(wú)原發(fā)病變后切斷前后交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶,完全切除內(nèi)側(cè)半月板,勿損傷軟骨面,徹底止血,生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔,行抽屜試驗(yàn)陽(yáng)性后逐層縫合關(guān)節(jié)囊、皮膚,無(wú)菌紗布包扎,不予固定;對(duì)照組僅打開關(guān)節(jié)腔,不損傷韌帶和半月板,縫合皮膚。術(shù)后每天肌內(nèi)注射青霉素40萬(wàn)U/kg,隔天傷口換藥,觀察傷口情況,連續(xù)7 d預(yù)防感染。根據(jù)超疲勞活動(dòng)易提前出現(xiàn)OA的發(fā)病特點(diǎn)[6],手術(shù)后1周,強(qiáng)迫動(dòng)物每天活動(dòng)30 min,分兩次驅(qū)趕,4周后即可獲得典型的OA模型。術(shù)后第5周開始,PRP組0.5 ml PRP關(guān)節(jié)腔注射;對(duì)照組、模型組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射等量生理鹽水,連續(xù)注射6周。

        1.4 樣本獲取及指標(biāo)檢測(cè)

        1.4.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)軟骨及滑膜組織中MMP-9表達(dá)量:取股骨內(nèi)髁軟骨修成0.2 cm×0.3 cm×0.3 cm的全層軟骨,10%甲醛固定,系列脫水、脫鈣,石蠟包埋,切片,按免疫組織化學(xué)試劑盒方法檢測(cè)軟骨中MMP-9的表達(dá)情況,隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野下軟骨細(xì)胞及滑膜細(xì)胞中MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值,即陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù),并利用圖像分析測(cè)量軟件Imagepro-plus計(jì)算平均積分光密度值。

        1.4.2 關(guān)節(jié)液及血清中MMP-9含量的測(cè)定:造模關(guān)節(jié)脫毛,酒精消毒,5 ml注射器行關(guān)節(jié)腔穿刺,關(guān)節(jié)腔注入1 ml無(wú)菌生理鹽水,反復(fù)沖洗后抽出,裝于2 ml離心管中,90 000×g下離心15 min,取上清待檢;取耳中靜脈血液,盛于5ml離心管中,90 000×g下離心15 min,取血清待檢。按試劑盒檢測(cè)方法檢測(cè)關(guān)節(jié)液及血液中MMP-9含量。

        對(duì)軟骨與滑膜中MMP-9的陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù)進(jìn)行相關(guān)性分析,對(duì)關(guān)節(jié)液中與血清中MMP-9含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS11.9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,各組間關(guān)節(jié)軟骨及滑膜細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及平均積分光密度的比較采用單因素方差分析,關(guān)節(jié)液及血液中MMP-9含量采用兩兩比較q檢驗(yàn),相關(guān)性采用Spearman進(jìn)行檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 軟骨組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)量:對(duì)照組軟骨細(xì)胞只見標(biāo)本表層極個(gè)別陽(yáng)性細(xì)胞,見圖1A,PRP組軟骨標(biāo)本的4層結(jié)構(gòu)中,可見到少量胞漿染成深棕色的陽(yáng)性細(xì)胞,見圖1B。模型組軟骨標(biāo)本的4層結(jié)構(gòu)中,均可見到胞漿染成深棕色的陽(yáng)性細(xì)胞,見圖1C。各組軟骨細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù)平均積分光密度值,見表1。

        表1 各組軟骨MMP-9表達(dá)情況()

        表1 各組軟骨MMP-9表達(dá)情況()

        注:與模型組比較,①P<0.05

        組別 陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù)(%) 平均積分光密度(aIOD)對(duì)照組 15.61±1.23① 0.09±0.02①PRP組 22.39±2.09① 0.13±0.04①模型組71.65±3.25 0.50±0.08

        2.2 滑膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)量:對(duì)照組滑膜MMP-9僅在少數(shù)滑膜細(xì)胞中分布,染色淡,散在分布,見圖2A。PRP組中少數(shù)滑膜細(xì)胞組織可見散在分布的淡染的陽(yáng)性細(xì)胞,在關(guān)節(jié)囊的滑膜下層偶爾見到少數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞,染色均淺,見圖2B。而模型組滑膜細(xì)胞層存在有大量陽(yáng)性細(xì)胞,染色較深,聚集現(xiàn)象明顯,滑膜下層也可見到大量陽(yáng)性細(xì)胞,染色較試驗(yàn)組深,甚至可見到染成深褐色的強(qiáng)陽(yáng)性滑膜細(xì)胞,見圖2C。各組關(guān)節(jié)滑膜MMP-9含量的平均積分光密度與陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù)詳見表2。

        2.3 各組動(dòng)物關(guān)節(jié)液中MMP-9濃度測(cè)定:顯示對(duì)照組為(22.51±1.21)ng/ml,PRP組和模型組關(guān)節(jié)液中MMP-9濃度分別為(45.63±2.96)ng/ml與(84.48±2.36)ng/ml,PRP組與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PRP組與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3A。對(duì)各組動(dòng)物血清中 MMP-9濃度測(cè)定顯示對(duì)照組為(4.37±1.32)ng/ml,PRP組和模型組關(guān)節(jié)液中MMP-9濃度分別為(9.87±1.52)ng/ml與(18.82±2.38)ng/ml,PRP 組與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PRP組與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3B。

        2.4 相關(guān)性分析:軟骨與滑膜中MMP-9的陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù)高度相關(guān),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖4A,關(guān)節(jié)液中與血清中MMP-9含量成高度正相關(guān),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4B。

        表2 各組滑膜中MMP-9表達(dá)情況()

        表2 各組滑膜中MMP-9表達(dá)情況()

        注:與模型組比較,①P<0.05

        組別 陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù)(%) 平均積分光密度(aIOD)對(duì)照組 13.68±0.69① 0.15±0.03①PRP組 17.26±0.54① 0.25±0.06①模型組38.24±1.95 0.49±0.07

        圖1 圖A:對(duì)照組軟骨細(xì)胞MMP-9免疫組化染色(400×);圖B:PRP組軟骨軟骨細(xì)胞MMP-9免疫組化染色(400×);圖C:模型組軟骨細(xì)胞MMP-9免疫組化染色(400×)

        圖2 圖A:對(duì)照組滑膜組織MMP-9免疫組化染色(400×);圖B:PRP組滑膜組織MMP-9免疫組化染色(400×);圖C:模型組滑膜組織MMP-9免疫組化染色

        3 討論

        圖3 圖A:各組動(dòng)物關(guān)節(jié)液中MMP-9濃度,與對(duì)照組比較①P<0.05,與模型組比較②Pp<0.05;圖B:各組動(dòng)物血清中MMP-9濃度,與對(duì)照組比較③P<0.05,與模型組比較④P<0.05

        圖4 圖A:各組動(dòng)物關(guān)節(jié)液與血清中MMP-9濃度成高度正相關(guān)(P<0.05);圖B:各組動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨與滑膜組中MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù)成高度正相關(guān)(P<0.01)

        骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis OA)的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了,但有關(guān)軟骨基質(zhì)的降解已得到共識(shí)[7]。關(guān)節(jié)軟骨屬于一種無(wú)血管、神經(jīng)及淋巴分布的透明軟骨,由軟骨細(xì)胞與軟骨基質(zhì)組成,基質(zhì)主要為蛋白多糖和糖蛋白形成的固相結(jié)構(gòu),膠原纖維存在其中,構(gòu)成網(wǎng)架結(jié)構(gòu),從而賦予關(guān)節(jié)軟骨的力學(xué)特征,基質(zhì)結(jié)構(gòu)特征和含量的任何異常,將導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[8]。目前研究證實(shí)骨關(guān)節(jié)炎的主要病理學(xué)特征之一是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解,而基質(zhì)的降解與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases-9,MMP-9)有關(guān)。MMP-9對(duì)蛋白聚糖有高度的裂解活性,在實(shí)驗(yàn)性O(shè)A的早期,MMP-9可降解Ⅺ型膠原,可能與OA早期膠原網(wǎng)絡(luò)水腫有關(guān)。MMP-9除能直接降解蛋白多糖的核心外,還可激活MMP-1,加速膠原的病理性降解,也使與透明質(zhì)酸相連的可聚蛋白多糖由于網(wǎng)絡(luò)的松解而丟失[9]。MMP-9能夠特異性裂解軟骨基質(zhì)中的膠原分子,破壞軟骨基質(zhì)的膠原網(wǎng)絡(luò),使軟骨細(xì)胞暴露于炎性因子的攻擊下而出現(xiàn)凋亡,導(dǎo)致軟骨的進(jìn)行性破壞[10]。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)模型組關(guān)節(jié)軟骨的4層結(jié)構(gòu)中,軟骨細(xì)胞均可見到胞漿染成深棕色,陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多,陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)烈,顆粒甚至呈深褐色,還可見表層軟骨大量的缺損。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)MMP-9在滑膜組織中也存在高表達(dá),這與現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎中高表達(dá)MMP-9的結(jié)論是一致的。

        PRP含有大量的生長(zhǎng)因子,其豐富的生長(zhǎng)因子中血小板源性化生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)、細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β,TGF-β)的含量分別為正常血液的30倍、10倍和7倍。研究發(fā)現(xiàn)PRP中的生物活性生長(zhǎng)因子能有效促進(jìn)骨缺損的修復(fù),其主要機(jī)制是在骨缺損局部的微環(huán)境中釋放一些生物活性成分[11]。PRP能促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)、促進(jìn)骨折愈合,其機(jī)制可能是與其對(duì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞具有多向分化潛能的生物學(xué)特性有關(guān)[12]。隨著基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)與臨床研究的發(fā)展,PRP在組織再生工程、軟骨以及軟組織修復(fù)再生等方面有著良好的生物學(xué)效應(yīng),用其來(lái)干預(yù)骨關(guān)節(jié)的病程有著較為理想的前景[13]。MMP-9抑制軟骨糖蛋白的合成,促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成和基質(zhì)微分子的降解,加重軟骨的損傷。關(guān)節(jié)內(nèi)局部高表達(dá)的MMP-9可能與其影響軟骨細(xì)胞增殖、軟骨損傷的反應(yīng)性和增強(qiáng)關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)有關(guān)[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PRP組機(jī)體內(nèi)MMP-9的含量較模型組顯著降低,軟骨細(xì)胞破壞程度明顯減輕,說(shuō)明PRP可通過(guò)降低機(jī)體內(nèi)MMP-9的含量,而起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。目前OA尚無(wú)有效的防治方法,因?yàn)楹苌儆兴幬锬芨淖僌A進(jìn)程。筆者的研究表明PRP能明顯降低MMP-9的含量,可起到保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用。

        本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物模型關(guān)節(jié)腔注射PRP 6周后,PRP組關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織中MMP-9含量較模型組減少,而與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明PRP只能延緩病程進(jìn)展而不能逆轉(zhuǎn)OA的病變進(jìn)程。模型組兔患側(cè)關(guān)節(jié)液中MMP-9含量明顯高于對(duì)照組,目前研究表明MMP-9對(duì)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)具有破壞作用,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡增多[15]。筆者的研究結(jié)果與目前的研究是一致的。在本研究中對(duì)各組動(dòng)物關(guān)節(jié)液中的MMP-9濃度進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果顯示對(duì)照組關(guān)節(jié)液中MMP-9濃度低于PRP組和模型組,PRP組關(guān)節(jié)液中MMP-9濃度明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究進(jìn)一步分析了各組動(dòng)物血清中MMP-9的濃度,也發(fā)現(xiàn)了類似關(guān)節(jié)液中MMP-9的檢測(cè)結(jié)果。且血清和關(guān)節(jié)液中MMP-9含量成高度正相關(guān),這說(shuō)明骨關(guān)節(jié)炎不單是一個(gè)局部關(guān)節(jié)的病變,在全身血清中都有MMP-9存在,只是病變局部關(guān)節(jié)其濃度明顯增高而已,這或許為以后MMP-9抑制劑治療骨關(guān)節(jié)炎提供了一定的參考理論基礎(chǔ)。

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