齊巍，李勇，琚紹靜，孫娜，張瑞杰

(1.河北省唐山市第二醫(yī)院 創(chuàng)傷一科，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市第二醫(yī)院骨病科，河北 唐山 063000；3.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

骨肉瘤是多發(fā)于青少年的惡性腫瘤，具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、轉(zhuǎn)移率高、侵襲力強(qiáng)等特點(diǎn)，是導(dǎo)致治愈率低的主要原因。細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜是惡性腫瘤局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要天然組織學(xué)屏障[1]。腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生多種蛋白水解酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，在癌細(xì)胞侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮作用，其中尤以基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase,MMP-9)發(fā)揮作用最為重要[2]。因此，探討其與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制及其關(guān)系具有重要的理論和臨床意義。本研究以骨肉瘤143B細(xì)胞為研究對(duì)象，研究MMP-9過(guò)表達(dá)對(duì)成骨肉瘤143B細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響，以及探討MMP-9及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等與骨肉瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人成骨肉瘤143B細(xì)胞株由華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，10% FBS、DMEM培養(yǎng)基和qRTPCR反應(yīng)試劑盒均購(gòu)置于美國(guó)Invitrogen公司,慢病毒過(guò)表達(dá)及陰性對(duì)照載體購(gòu)置于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，pLV-Puro MMP-9陽(yáng)性序列:5'-UCCAGGGCGAGGACCAUAGAG-3'、pLV-Puro MMP-9陰性對(duì)照序列:5'-ACGUGACACGUUCGGA GAAGTCT-3'、Transwell小室購(gòu)置于以色列BI公司，MMP-9和VEGF一抗和二抗均購(gòu)置于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，JSM-6030LV激光共聚焦顯微鏡購(gòu)置日本電子株式會(huì)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染 骨肉瘤143B細(xì)胞用含10%FBS、1%(100μmg/ml青霉素和10μmg/ml鏈霉素)的DMEM完全培養(yǎng)基，并置于37℃、5% 二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80%時(shí)可進(jìn)行消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)消化143B細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml，接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為3組:轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染pLV-Puro MMP-9過(guò)表達(dá)序列)、對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pLV-Puro MMP-9-NC序列)、空白組(PBS)。參照吉?jiǎng)P慢病毒轉(zhuǎn)染說(shuō)明書進(jìn)行操作，48 h后激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 收集各組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，參照Trizol說(shuō)明書一步法提取細(xì)胞MMP-9和VEGF的總RNA，檢測(cè)RNA濃度復(fù)合實(shí)驗(yàn)要求后，取2 μl總RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取1 μl cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，MMP-9引物序列正向引物:5'-CTGTTGG ACTGCTGCTTTGCTG-3'；反向引物:5'-GTCTCCTGA AAGGTTTGGAAT-3'。β-actin引物序列正向引物:5'-GTTGGGACCTGAGAGACTA-3'；反向引物:5'-TGGCG ATGTCCAG TCACACT-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性20 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)后再72℃延伸10 min。采用比較2-△△Ct法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 Western blot檢測(cè)MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染后48 h收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，每組樣品取35 μg蛋白質(zhì)/泳道，進(jìn)行SDSPAGE電泳，分別制配5%的濃縮膠和10%的分離膠，設(shè)置電壓和電流進(jìn)行電轉(zhuǎn)，設(shè)置250 mA 90 min將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；分別滴加150 μl一抗MMP-9和VEGF(1:2 000)以及一抗β-actin(1:1 000)，4℃過(guò)夜；TBST洗膜，每次10 min×3次；加相應(yīng)100 μl二抗MMP-9和VEGF (1:1 000)，37℃培養(yǎng)1.5 h；TBST洗膜，每次10 min×3次。進(jìn)行ECL顯色，掃描儀掃描條帶分析光密度值。

1.2.4 Tanswell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 以預(yù)冷空白培養(yǎng)基DMEM按1:8的比例稀釋膠體，取100 μl稀釋液滴加于Transwell小室的上室，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基箱1 h即可制成Matrigel膠，常規(guī)消化單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml；以100 μl/孔滴加至Transwell小室上層，滴加500 μl(20% FBS)的DMEM至下室，常規(guī)培養(yǎng)24 h。吸去小室內(nèi)液體，使用濕潤(rùn)棉簽輕拭擦去小室上層的Matrigel膠和未穿透過(guò)的細(xì)胞，將小室底部的聚碳酸酯膜用刀片切割下來(lái)，置于4%多聚甲醛液中，固定30 min以上；PBS沖洗3遍，對(duì)酯膜進(jìn)行蘇木素染色，封片。倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞并拍照，觀察每個(gè)視野內(nèi)穿過(guò)脂膜的細(xì)胞數(shù)量，以穿過(guò)脂膜的細(xì)胞總數(shù)為指標(biāo)評(píng)價(jià)細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 采用記號(hào)筆在6孔板背面畫出均勻間隔0.8 cm左右的橫線，橫穿過(guò)孔，每孔至少穿過(guò)5條線。各組細(xì)胞常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml。細(xì)胞生長(zhǎng)良好融合率達(dá)到80%時(shí)用10 μl的槍頭作劃痕，劃痕完畢后，PBS輕輕沖洗3遍，漂洗去除劃下的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。按0和24 h時(shí)間點(diǎn)取樣，拍照，并測(cè)量多個(gè)點(diǎn)劃痕寬度，計(jì)算平均劃痕愈合率。用Image J軟件分析培養(yǎng)0和24 h時(shí)的各組劃痕情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率

根據(jù)最強(qiáng)紅色熒光判斷轉(zhuǎn)染率，激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率證實(shí)慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染率高，可達(dá)90%以上。見圖1。

圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率 (激光共聚焦顯微鏡×400)

2.2 MMP-9和VEGF的mRNA表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)組MMP-9和VEGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組和空白組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組MMP-9和VEGF的mRNA表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組和空白組均增高(P ＜0.05)，而空白組和對(duì)照組之間MMP-9和VEGF的mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.625和16.472，P =0.165和0.072)。見表1和圖2。

表1 各組MMP-9 mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)量(n =6，±s)

表1 各組MMP-9 mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)量(n =6，±s)

注:?與對(duì)照組、空白組比較，P ＜0.05

?

圖2 各組MMP-9 mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)量

2.3 MMP-9和VEGF的蛋白表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)組MMP-9和VEGF的蛋白相對(duì)光密度值均高于空白組和對(duì)照組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組MMP-9和VEGF的蛋白表達(dá)量均高于空白組和對(duì)照組(P ＜0.05)，而空白組和對(duì)照組MMP-9和VEGF的蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.206和12.572，P =0.106和0.060)。見表2和圖3。

表2 各組細(xì)胞MMP-9、VEGF蛋白的表達(dá)(n =6，±s)

表2 各組細(xì)胞MMP-9、VEGF蛋白的表達(dá)(n =6，±s)

注:?與空白組和對(duì)照組比較，P ＜0.05

?

2.4 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)

圖3 各組蛋白表達(dá)水平

圖4 各組細(xì)胞的侵襲能力 (蘇木素染色×200)

圖5 各組細(xì)胞的遷移情況 (×40)

實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)人工基底膜細(xì)胞數(shù)為(92.80±2.65)個(gè)/視野，對(duì)照組為(56.80±5.37)個(gè)/視野，空白組為(54.80±2.90)個(gè)/視野(見圖4)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，個(gè)/視野，對(duì)照組為(56.80±5.37)個(gè)/視野，空白組為(54.80±2.90)個(gè)/視野(見圖4)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組和空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.214，P =0.012)，而對(duì)照組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=28.057，P =0.086)。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的侵襲能力增高。

2.5 細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力

實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組劃痕愈合率分別為(68.58±3.48)%、(32.17±3.25)%、(29.13±4.18)%(見圖5)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組細(xì)胞劃痕愈合率比較，空白組和對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.207，P =0.155)，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞劃痕愈合率高于對(duì)照組和空白組(F=13.355，P =0.030)。表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移速度快于對(duì)照組及空白組。

3 討論

骨肉瘤為青少年最常見惡性腫瘤，惡性程度高，具有很高的致殘率和致死率，侵襲性強(qiáng)，轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后較差[3]。調(diào)查資料顯示，骨肉瘤易于肺部轉(zhuǎn)移[4]。臨床治療骨肉瘤以手術(shù)截肢和輔助放化療為主，患者的生存率無(wú)提高[5]。腫瘤轉(zhuǎn)移早和術(shù)后易復(fù)發(fā)是影響骨肉瘤治療和生存率的重要因素[6]。在監(jiān)控骨肉瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)方面至今為止尚缺乏針對(duì)性的預(yù)測(cè)靶基因和腫瘤標(biāo)志物，尋找針對(duì)骨肉瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于骨肉瘤的早期診斷、早期治療及預(yù)后檢測(cè)具有重要的意義，因此，研究骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)相關(guān)的作用機(jī)制具有重要臨床意義。本研究以骨肉瘤143B為研究對(duì)象，試圖探索MMP-9過(guò)表達(dá)對(duì)成骨肉瘤143B細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響。以及探討MMP-9及VEGF與骨肉瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是鋅離子依賴性蛋白水解酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)的成分，與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、血管形成關(guān)系十分密切，細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附及細(xì)胞外基膜的降解被認(rèn)為是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的首要條件[7]。MMP-9是(MMPs)家族中重要的一員，屬于Ⅳ型膠原酶，MMP-9蛋白酶是降解Ⅳ型膠原最重要的酶，與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及血管形成能力有關(guān)[8-9]，并參與細(xì)胞外基質(zhì)降解和再塑。MMP-9具有降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞細(xì)胞的天然屏障的作用，同時(shí)具有調(diào)控細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附作用，促使癌細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[10]；并且MMP-9還可以協(xié)同纖維蛋白溶解酶和組織蛋白酶等酶類，降解血管周圍基質(zhì)和血管基底膜[11]。這一過(guò)程強(qiáng)化癌細(xì)胞的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。李昕等[12]探討MMP在骨肉瘤中的表達(dá)及與侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)骨肉瘤MMP-9的表達(dá)，并分析其與無(wú)瘤生存率和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MMP-9與骨肉瘤細(xì)胞的高侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。陳雷等[13]研究骨肉瘤組織中基MMP-9的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MMP-9可作為骨腫瘤惡性表型的標(biāo)志，可作為骨肉瘤診斷的輔助指標(biāo)，MMP-9是骨肉瘤細(xì)胞侵襲的標(biāo)志。同樣，LV等[14]在骨肉瘤患者發(fā)現(xiàn)，5年內(nèi)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移患者中MMP-9陽(yáng)性率明顯高于5年內(nèi)未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移患者，表明MMP-9高表達(dá)與骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，MMP-9有可能成為骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)MMP-9過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染人骨肉瘤143B細(xì)胞，Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的侵襲能力高于對(duì)照組和空白組，MMP-9過(guò)表達(dá)可促進(jìn)增加骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞劃痕愈合率高于對(duì)照組和空白組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移速度快于對(duì)照組及空白組。說(shuō)明MMP-9過(guò)表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤143B細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

VEGF是目前作用最強(qiáng)的一種促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)因子，通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體結(jié)合促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加微血管通透性，促進(jìn)血管形成。同時(shí)它可以旁分泌的方式作用于內(nèi)皮細(xì)胞，刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌MMP-9。VEGF與腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)MMP-9在降解細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)程中，能夠釋放出生長(zhǎng)因子如b-FGF、TGF-β等，它們能夠上調(diào)VEGF的表達(dá)[15]。黃自鋒等[16]研究MMP-9、VEGF的表達(dá)與骨肉瘤血管新生及臨床復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-9、VEGF共同參與骨肉瘤的血管生成并協(xié)同表達(dá)。李昱等[17]發(fā)現(xiàn)分化程度較低、浸潤(rùn)程度較深、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期較高的非小細(xì)胞肺癌患者，同時(shí)伴有MMP-9與VEGF的高表達(dá)，提示MMP-9與VEGF有著內(nèi)在聯(lián)系，MMP-9作用于VEGF因子。本研究以慢病毒介導(dǎo)MMP-9過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染人骨肉瘤143B細(xì)胞，qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組MMP-9和VEGF mRNA的表達(dá)量增高，免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)量增高，并促進(jìn)骨肉瘤143B細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。同樣，有研究發(fā)現(xiàn)VEGF可通過(guò)ETS-1調(diào)節(jié)MMP-9啟動(dòng)子從而上調(diào)MMP-9 mRNA的表達(dá)[18]。POYER等[19]發(fā)現(xiàn)MMP-9與VEGF之間相互調(diào)節(jié)促進(jìn)對(duì)方的分泌，兩者之間存在著正反饋調(diào)節(jié)作用。

在腫瘤細(xì)胞從增殖到局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移這一過(guò)程，蛋白水解酶介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)降解、基底膜降解和腫瘤微血管的形成起到關(guān)鍵作用。MMP-9和VEGF在骨肉瘤的的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，骨肉瘤中MMP-9和VEGF可作為評(píng)價(jià)骨肉瘤預(yù)后指標(biāo)，目前從臨床研究已初步揭示了MMP-9和VEGF表達(dá)水平與骨肉瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系。同時(shí)，通過(guò)對(duì)其調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步深入研究，將有助于找到治療骨肉瘤轉(zhuǎn)移的有效生物靶點(diǎn)，給廣大骨肉瘤患者帶來(lái)福音。