簡曉莉，劉志承，李曙光，劉紀(jì)青

（廣東省深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033）

痤瘡散為我院臨床應(yīng)用20多年的院內(nèi)制劑，有清熱、祛風(fēng)、殺蟲等作用，主要用于治療痤瘡，外用療效顯著［1－3］。2015 年版《中國藥典（四部）》的微生物限度檢查法結(jié)合國情、參考歐美藥典進行了修訂，與2010年版《中國藥典》的方法相比，在培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和檢驗方法上均有重大改進［4］。為了提高痤瘡散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保醫(yī)院制劑的用藥安全，本研究中根據(jù)2015年版《中國藥典（四部）》［5］微生物限度檢查法中的相關(guān)規(guī)定，對痤瘡散的微生物限度檢查法進行重新修訂，并進行了適用性試驗?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與材料

1.1 儀器

TX323L型電子天平（日本島津公司）；LMQ.C型高壓蒸汽滅菌器（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；SPX－150BY－Ⅱ型生化培養(yǎng)箱（北京鑫騰達儀器設(shè)備有限公司）；HH.B11.500－BY －Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱（廣州永程科學(xué)設(shè)備有限公司）；電恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；1300 A2型生物安全柜（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）。

1.2 試藥

痤瘡散（深圳市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號分別為20160223，20160303，20160309）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基 （TSA，批號為 3105210），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號為3105268），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號為3105171），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，批號為3105054），甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號為3105175），溴化十六烷基三甲瓊脂培養(yǎng)基（批號為3105130），無菌氯化 －蛋白胨緩沖液（pH ＝7.0，批號為 3105256），均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 試驗菌株

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］菌種，均購自中國食品藥品檢定研究院，且均使用第3代培養(yǎng)物。

2 方法與結(jié)果

2.1 微生物計數(shù)法適用性試驗

2.1.1 菌液制備

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌：取TSB新鮮培養(yǎng)液，稀釋至不大于100 cfu／mL，備用。

白色念珠菌：取SDB新鮮培養(yǎng)液，稀釋至不大于104cfu／mL 及不大于 100 cfu／mL，備用。

黑曲霉：取孢子懸液，稀釋至不大于104cfu／mL及不大于100 cfu／mL，備用。

2.1.2 供試液制備

從2個（或以上）包裝中取本品10 g，加稀釋液至100 mL，45 ℃保溫振搖使其分散均勻（pH ＝6.5），靜置，取上清液，得1∶10供試液；取1∶10供試液，分別稀釋成 1 ∶20，1 ∶50，1 ∶100的供試液。

2.1.3 供試液中微生物的回收

需氧菌總數(shù)（平皿傾注法）：試驗組取無菌試管5 支，分別加 2.1.2 項下制備的供試液各 9.9 mL 及2.1.1 項下制備的菌液各 0.1 mL，混勻，取 1 mL 置無菌平皿中，傾注TSA依法培養(yǎng)、計數(shù)，每株試驗菌平行制備2個平皿。供試液對照組取無菌試管1支，以稀釋液替代菌液，同試驗組操作。菌液對照組取無菌試管5支，以稀釋液替代供試液，同試驗組操作。

需氧菌總數(shù)（薄膜過濾法）：試驗組取2.1.2項下制備的1∶20供試液的上清液1 mL，加至裝有100 mL pH＝7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液過濾器中（φ75 mm濾膜），混勻，濾盡，再按 300 mL／膜（沖洗 3次，每次100 mL）的沖洗量沖洗，在最后100 mL沖洗液中各加2.1.1 項下制備的菌液 1 mL（不大于 100 cfu ／mL），取濾膜依法培養(yǎng)、計數(shù)。供試液對照組除不加菌外同試驗組操作。菌液對照組以稀釋液替代供試液，同試驗組操作。

霉菌和酵母菌總數(shù)（平皿傾注法）：試驗組取無菌試管 2支，分別加 2.1.2項下制備的 1∶10，1∶20供試液9.9 mL及2.1.1項下制備的白色念珠菌及黑曲霉菌液各0.1 mL，混勻，取1 mL于無菌平皿中，傾注SDA依法培養(yǎng)、計數(shù)，每株試驗菌平行制備兩個平皿。供試液對照組取無菌試管1支，以稀釋液替代菌液，同試驗組操作。菌液對照組取無菌試管2支，以稀釋液替代供試液，同試驗組操作。

2.1.4 微生物回收率計算

微生物回收率＝（試驗組菌落數(shù)－供試液對照組菌落數(shù)）／菌液對照組菌落數(shù)×100%。結(jié)果見表1和表2。

表1 需氧菌總數(shù)計數(shù)適用性試驗回收率（%）

表2 真菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)適用性試驗回收率（%）

2.2 控制菌檢查法適用性試驗

2.2.1 菌液制備

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌：取TSB新鮮培養(yǎng)液，稀釋至不大于100 cfu／mL，備用。

2.2.2 金黃色葡萄球菌檢查方法適用性試驗

增菌培養(yǎng)：試驗組取 100，200，500 mL TSB，加2.1.2項下制備的 1 ∶10供試液 10 mL 及 2.2.1 項下制備的金黃色葡萄球菌1 mL，混勻，依法培養(yǎng)18～24 h。供試液對照組以稀釋液代替菌液，同試驗組操作。陰性對照組以稀釋液替代供試液及菌液，同試驗組操作。

選擇和分離培養(yǎng)：取增菌培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72 h。

2.2.3 銅綠假單胞菌檢查方法適用性試驗

增菌培養(yǎng)：試驗組取 100 mL TSB，加 2.1.2項下制備的1∶10供試液10 mL及2.2.1項下制備的銅綠假單胞菌1 mL，混勻，依法培養(yǎng)18～24 h。供試液對照組以稀釋液代替菌液，同試驗組操作。陰性對照組以稀釋液替代供試液及菌液，同試驗組操作。

選擇和分離培養(yǎng)：取增菌培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72 h。結(jié)果見表 3。

表3 金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌適用性試驗結(jié)果

3 討論

本品劑型為散劑，在需氧菌總數(shù)薄膜過濾法試驗中，1∶10供試液上清液易吸入藥品粉末，過濾困難，經(jīng)紗布過濾仍難以改善，故取1∶20供試液進行薄膜過濾法方法適用性試驗。

本品由大黃、黃連、白芷、防風(fēng)等9味藥組方，這些藥物成分對微生物均有抑制作用［6－15］。3批樣品的驗證試驗結(jié)果表明，本品對需氧菌中的枯草芽孢菌、白色念珠菌有抑制作用，對金黃色葡萄球菌有較強抑菌性。采用1∶100稀釋級供試液進行平皿法試驗，金黃色葡萄球菌幾乎沒有回收。采用薄膜過濾法，用300 mL pH＝7.0的氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗即可消除其抑菌作用，回收率在2015年版《中國藥典（四部）》附錄規(guī)定的50%～200%之間，說明薄膜過濾法應(yīng)用于本品需氧菌總數(shù)的微生物檢查具有可行性。由表2可見，本品對霉菌及酵母菌總數(shù)中的白色念珠菌有微弱的抑菌性，采用1∶20供試液進行平皿法試驗?zāi)芟湟志裕?種試驗菌均在2015年版《中國藥典（四部）》附錄規(guī)定的50% ～200%之間，方法可行?？刂凭椒炞C試驗結(jié)果表明，本品對金黃色葡萄球菌有較強抑制作用，加入100 mL及200 mL培養(yǎng)液，試驗組仍無菌生長，需加培養(yǎng)液至500 mL才能消除其抑菌性。由表3可見，采用常規(guī)方法檢查痤瘡散中的銅綠假單胞菌，試驗組為陽性，方法可行。本方法驗證結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可用于痤瘡散的微生物限度檢查。