范東旭，劉彥東*，薛金枝，王瀚銳，程明勛，金 松

（1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.大慶市第四醫(yī)院，黑龍江 大慶 163712）

隨著糖尿病患者在血管外科患者中所占比例逐漸增加，引起血管外科醫(yī)生高度重視，對糖尿病患者血管再生的研究成為熱點，相關(guān)研究證明，Notch信號通路能促進非糖尿病動物缺血區(qū)的血管新生、動靜脈分化等，本課題應(yīng)用不同濃度的γ-分泌酶抑制劑（DAPT）對Notch信號通路的關(guān)鍵酶γ-分泌酶進行抑制，探尋適宜血管再生的濃度，為進一步研究DM下肢缺血區(qū)血管新生提供實驗理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 組織來源

已完成鑒定凍存的糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞。

1.2 試劑

0.25%胰酶細(xì)胞消化液 invitrogen 公司，TRYPSIN 0.25%EDTA（25200056 Life），D-PBS （sh30028.01B Hyclone），D-Hank’s液（不含Ca、Mg）（sh30030.03B Hyclone），γ-分泌酶抑制劑（DAPT）（美國Sigma公司），細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（MTT BB-4201貝博生物）。

1.3 培養(yǎng)基

在DMEM培養(yǎng)液（Gibco BRL，USA）培養(yǎng)基中添加15%胎牛血清（南美）（sv30087.02 Hyclone）、1%青霉素、1%鏈霉素，200目篩，一次性過濾除菌器除菌備用（4周內(nèi)用完）。

1.4 器械及儀器

T25培養(yǎng)瓶，倒置顯微鏡，細(xì)胞計數(shù)板、超凈工作臺，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板Corning Inc等。

2 方 法

2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及傳代[1-2]

從液氮罐中取冷凍管，迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，使其1 min內(nèi)完全融化，

然后在超凈工作臺中打開凍存管，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中，滴加10ml 培養(yǎng)液；

然后1000 r/min離心5 min，棄上清，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1*10g/L，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況，若細(xì)胞在80%～90%融合時即可細(xì)胞傳代，以后根據(jù)情況在長滿1～2天后開始傳代；所有操作均在超凈工作臺中進行，將細(xì)胞懸液按1：2傳代培養(yǎng)，加入培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后，置37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換培養(yǎng)液一次，傳代至第3代時可進行MTT實驗。

2.2 MTT實驗[3]

用0.25%胰蛋白酶消化并收集DM大鼠VSMCs，計數(shù)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。以2.0×104/ml、200 μl/孔接種于96孔板上，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。將γ-分泌酶抑制劑DAPT儲存溶液倍比稀釋為工作液終濃度分別為0.15、0.30、0.45、0.6、0.75、1.25、2.5、5、7.5、10、20 μmol/L，對照組不加，按濃度于96孔板上設(shè)置12排/板，共設(shè)置10個板；分別于0、12、24、48、72小時取出96孔板，每孔加入5 mg/ml MTT 20μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清；每孔加入150 μl DMSO：無水乙醇=1：1的混合液震蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解；在酶標(biāo)儀上，以波長570 nm測定各孔光密度（Optical density，OD）值；以（OD測定孔-OD空白孔）表示每組的實際OD值；以正常對照組的細(xì)胞活力為100%，各實驗組的細(xì)胞活力=OD實驗組的實際值/OD對照組的實際值。

3 結(jié) 果

與對照組相比，不同濃度的DAPT（0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00、20.00μmol/L）對DM大鼠VSMCs有抑制作用，這種抑制作用在0.15～7.50μmol/L濃度之間呈時間-濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），7.50μmol/L濃度以上無明顯變化，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；根據(jù)作用曲線，各時間段DAPT對DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率大約出現(xiàn)在0.15 μmol/L和2.50 μmol/L，且72小時時對DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率較其余各時間段明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

4 討 論

糖尿病血管并發(fā)癥是糖尿病患者主要致殘、致死原因[4]。流行病學(xué)調(diào)查研究表明，糖尿病患者發(fā)生心腦血管并發(fā)癥的危險性較正常人增加34倍，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）是動脈壁的主要組成成分，在糖尿病血管并發(fā)癥的動脈粥樣硬化形成中起著關(guān)鍵作用，因此對VSMC 的研究有著重要的意義。相關(guān)研究證明：Notch信號通路能促進非糖尿病動物缺血區(qū)的血管新生、動靜脈分化等；本課題證明題DAPT對DM大鼠VSMCs有抑制作用，這種抑制作用在0.15～7.50μmol/L濃度之間呈時間-濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），7.50 μmol/L濃度以上無明顯變化，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；根據(jù)作用曲線，各時間段DAPT對DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率大約出現(xiàn)在0.15 μmol/L和2.50 μmol/L，且72小時時對DM大鼠VSMCs細(xì)胞的半抑制率較其余各時間段明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。證明Notch信號通路通過受體、配體、下游信號等各種蛋白共同作用下，在一定程度上可促進糖尿病患者下肢缺血區(qū)的血管再生，隨著對Notch信號通路研究的深入和對血管新生影響機制的闡明以及促血管或抑制血管新生方法的不斷完善，一定能為相關(guān)血管疾病治療提供重要策略和新的靶點。