亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        miR-203表達(dá)異常與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

        2018-08-14 09:57:52戴磊吳賢江張舟徑李健君
        關(guān)鍵詞:封二乙?;?/a>熒光素酶

        戴磊,吳賢江,張舟徑,李健君

        甲狀腺癌的發(fā)病率近年來(lái)逐步上升,已成為最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤[1]。新病例在全世界范圍內(nèi)幾乎為300000例,平均年齡為50歲,每年有近40000人死亡[2]。而甲狀腺乳頭狀癌(PTC)正是所有甲狀腺惡性腫瘤中最常見(jiàn)的病理分型,其發(fā)病率也在逐年上升[2]。進(jìn)一步了解甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生及發(fā)展的分子學(xué)機(jī)制有助于進(jìn)一步提高患者的生存率,并為一些中晚期的特殊患者提供新的治療方案。miRNAs是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控,從而進(jìn)一步調(diào)控某些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)[3]。該類(lèi)分子在人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中也起到了重要的生物學(xué)作用,目前已知的與甲狀腺乳頭狀癌密切相關(guān)的 miRNA有:miR-146b,miR-222,miR-221和miR-151;而miR-222,miR-221與甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的遷徙性更有著密切的關(guān)系[4-5]。而外周循環(huán)血中miR-222和miR-146b的水平被報(bào)道與甲狀腺乳頭狀癌的不良預(yù)后相關(guān)。研究表明miR-203在胃癌、直結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌及皮膚黑色素瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中均起到了關(guān)鍵的作用[6-9]。而miR-203與甲狀腺乳頭狀癌之間的關(guān)系并沒(méi)完善的研究進(jìn)行報(bào)道。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-203在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況及目標(biāo)基因進(jìn)行了驗(yàn)證,進(jìn)一步闡述了miR-203生物學(xué)作用?,F(xiàn)報(bào)道如下。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 收集寧波市第二醫(yī)院甲狀腺外科2016年3月到2017年3月行甲狀腺手術(shù)患者病理標(biāo)本70例,其中甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本40例,甲狀腺良性腫瘤標(biāo)本30例。新鮮標(biāo)本均在手術(shù)后立即于液氮存放,所有甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本均由細(xì)針穿刺、術(shù)中冰凍病理及術(shù)后常規(guī)石蠟標(biāo)本3次確認(rèn)。其中10例甲狀腺乳頭狀癌及10例匹配對(duì)照甲狀腺良性腫瘤組織用于基因芯片使用。人甲狀腺濾泡細(xì)胞細(xì)胞系為:Nthy-ori3-1;人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系包括:HTH83、NIM-1和TPC-1,上述四株細(xì)胞系均購(gòu)買(mǎi)于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),用10%胎牛血清(HyClone、Logan,USA)及 100 U/ml青霉素的 DMEM(Gibco、Carlsbad,USA)培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境為37℃的含5%CO2的濕潤(rùn)空氣。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞增殖 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24 h接種于96孔板,5 000細(xì)胞/孔。接種48 h后CCK8試劑盒(Dojindo、Kumamoto、Japan)計(jì)數(shù),450nm吸光度由全自動(dòng)酶標(biāo)儀(SpectraMax190,USA)測(cè)量。

        1.2.2 細(xì)胞侵襲 接種1×104培養(yǎng)細(xì)胞于用Matrigel(BDBiosciences)覆膜的Tranwells上腔室,待Matrigel干燥后,抽去上層的DMEM,用500lPBS沖洗凝膠。培育24 h后將未透膜的細(xì)胞小心擦除,甲醇固定后用4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色,每膜用熒光倒置顯微鏡隨機(jī)取5個(gè)視野并計(jì)數(shù)。

        1.2.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄熒光 PCR 細(xì)胞及組織總RNA使用Trizol(LifeTechnologies,USA)按照說(shuō)明書(shū)提取并于-80℃保存?zhèn)溆?。使用TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成總cDNA后由特異性引物按照SYBR Green(Finzyme)試劑盒要求行熒光PCR檢測(cè),定量計(jì)算內(nèi)參選擇為:mRNA參照GAPDH;miRNA參照miR-16。

        1.2.4 Western blot檢測(cè) 細(xì)胞及組織總蛋白由RIPA(Thermal)及蛋白酶(Sigma-Aldrich)預(yù)混液制備,10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜(RocheDiagnostics,Switzerland)。5%脫脂牛奶阻斷后,轉(zhuǎn)膜由特定抗體孵育過(guò)夜。

        1.2.5 熒光素酶檢測(cè) 將用熒光素標(biāo)記酶標(biāo)記3’-UTR(野生和變異型survivin)的HEK 293T細(xì)胞接種于24孔板,加入10ngpRL-TK和20pmolmiRNA模擬品。用雙熒光素酶報(bào)告試劑盒(Promega、Madison,USA)在轉(zhuǎn)染后48 h檢測(cè)熒光量。

        2 結(jié)果

        2.1 miR-203在甲狀腺乳頭狀癌及癌細(xì)胞系中表達(dá)miR-203在甲狀腺乳頭狀癌及3株甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系中表達(dá)較正常甲狀腺組織表達(dá)明顯下降(封二彩圖1)。

        2.2 細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-203與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系 CCK8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)均證明在轉(zhuǎn)染miR-203模擬品組對(duì)比miR-NC組中腫瘤細(xì)胞的活性被明顯抑制,而凋亡水平明顯上升(封二彩圖2)。Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-203對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲力的影響,轉(zhuǎn)染miR-203 TPC-1細(xì)胞惡性程度和侵襲力均明顯下降。

        2.3 miR-203和目標(biāo)基因survivin之間的關(guān)系 在甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本及乳頭狀癌細(xì)胞系中 survivin mRNA及蛋白的表達(dá)量均有所上升(封二彩圖3)。分別在TPC-1細(xì)胞中建立了野生型和突變型survivin3′UTR的熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)miR-203能成功阻斷含野生型survivin3′UTR的熒光素酶而對(duì)突變型無(wú)效(封二彩圖3C);同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-203 siRNA阻斷miR-203的TPC-1細(xì)胞中survivin的表達(dá)量明顯上升(封二彩圖3D、E)。

        2.4 miR-203啟動(dòng)子區(qū)乙?;cmiR-203表達(dá)的關(guān)系 經(jīng)TSA處理的TPC-1細(xì)胞miR-203表達(dá)量顯著增加并隨TSA劑量的增加而增加(圖1)。

        3 討論

        甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是目前臨床上最常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤,早期沒(méi)有特異的臨床表現(xiàn),這使該疾病的早期診斷變得困難重重[10]。大多數(shù)患者預(yù)后良好,10年生存率約為90%。然而,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率卻高達(dá)20~50%[2],而PTC患者接受全甲狀腺切除術(shù)的區(qū)域復(fù)發(fā)率為5~20%[4]。目前常用的治療手段有手術(shù)治療、內(nèi)放射治療及內(nèi)分泌抑制治療,在非遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中治療后的5年生存率超過(guò)95%。但是仍有部分患者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部淋巴結(jié)的復(fù)發(fā),而這一情況在某些特殊的甲狀腺乳頭狀癌病理分型中尤其明顯,而有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)的患者的5年生存率則降至59%[11]。

        圖1 阻斷啟動(dòng)子區(qū)乙?;瘜?dǎo)致miR-203表達(dá)量上升

        miRNAs是一類(lèi)非編碼短RNA,在細(xì)胞活動(dòng)的周期里起到重要的調(diào)節(jié)作用,在多種惡性腫瘤包括甲狀腺癌中miRNA也起到了重要的作用[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs通過(guò)調(diào)制腫瘤形成發(fā)生的途徑從而在致癌和腫瘤抑制中的作用。此外,幾個(gè)miRNAs被報(bào)道與腫瘤的增殖、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)[12]。miR-146b[13],miR-222[14]及 miR-20b[15]均被研究者證明在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中能起到促進(jìn)或是抑制的作用。但同時(shí)更多的miRNA的生物學(xué)作用和分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

        有報(bào)道稱(chēng)miR-203在皮膚黑色素瘤[8]及非小細(xì)胞肺癌[12]均低表達(dá),這提示miR-203可能在更多的惡性腫瘤中起到關(guān)鍵作用。本研究通過(guò)Affymetrix芯片發(fā)現(xiàn)miR-203在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)也被抑制,但其生物學(xué)作用及分子學(xué)機(jī)制未被詳細(xì)報(bào)道。因此繼續(xù)通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)了survivin可能是miR-203的上游調(diào)節(jié)基因。相關(guān)報(bào)道描述 survivin在甲狀腺乳頭狀癌及局部轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)標(biāo)本中均有很高表達(dá)[16],考慮survivin與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷均有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)miR-203表達(dá)情況與survivin表達(dá)呈現(xiàn)相反變化趨勢(shì),進(jìn)一步完善了survivin與甲狀腺乳頭狀癌之間關(guān)系的研究。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)乙?;窃斐蒻iR-203表達(dá)降低的重要的機(jī)制。

        通過(guò)本研究,筆者總結(jié)如下:(1)PTC組織中miR-203表達(dá)較正常組織明顯減少;(2)阻斷miR-203的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系細(xì)胞中survivin過(guò)表達(dá);(3)阻斷乙酰化可使腫瘤細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)的miR-203表達(dá)量恢復(fù)正常。以上結(jié)論均說(shuō)明miR-203在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生過(guò)程中起到重要作用,而作為可檢測(cè)的小分子,miR-203極有可能成為甲狀腺乳頭狀癌的診斷或預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物;同時(shí)作為可被調(diào)控的生物靶點(diǎn),miR-203也可作為今后靶向治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

        猜你喜歡
        封二乙?;?/a>熒光素酶
        封二
        作品(2022年10期)2022-10-18 10:24:18
        抑癌蛋白p53乙?;揎椀恼{(diào)控網(wǎng)絡(luò)
        封二
        作品(2022年6期)2022-06-30 09:45:38
        NNMT基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗(yàn)證
        封二
        孫子研究(2021年1期)2021-05-12 01:01:36
        不同雙熒光素酶方法對(duì)檢測(cè)胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
        重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)
        慢性支氣管哮喘小鼠肺組織中組蛋白H3乙?;揎椩鰪?qiáng)
        組蛋白去乙?;敢种苿┑难芯窟M(jìn)展
        人多巴胺D2基因啟動(dòng)子區(qū)—350A/G多態(tài)位點(diǎn)熒光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定及活性檢測(cè)
        av一区二区三区在线| 成人国产精品免费网站| 久久国产精品av在线观看| 在线观看 国产一区二区三区| 国产精品永久免费| 国内精品久久久久久久久久影院| 日日噜噜噜夜夜爽爽狠狠视频| 成人av资源在线播放| 日本丰满熟妇videossexhd| 国产第一页屁屁影院| 亚洲AV日韩Av无码久久| 亚洲中文字幕一区精品| 中文字幕亚洲综合久久菠萝蜜| 久久精品国产亚洲av忘忧草18| 无码视频一区二区三区在线播放| 免费视频亚洲一区二区三区| 免费人成在线观看网站| 国产精品揄拍100视频| 亚洲精品高清av在线播放| 成人自拍一二在线观看| 日韩中文字幕免费视频| 欧美在线不卡视频| 日本一区二区精品色超碰| 国产网站一区二区三区| 国产美女自慰在线观看| 亚洲大片免费| 天堂网av在线免费看| 无码一区二区三区免费视频| 亚洲av日韩精品久久久久久| 天堂av在线一区二区| 亚洲国产一区二区三区| 国产精品无码久久久久| 国产亚洲午夜精品| 熟女少妇精品一区二区三区| 一本色道久久爱88av| 全免费a级毛片免费看视频| 韩国免费一级a一片在线| 日本精品一区二区三区二人码| 国产精品人妻一码二码尿失禁 | 性色av手机在线观看| 少妇高潮太爽了在线看|