叢 晶，王 順，張多加，彭 艷，張?zhí)鞁?，沈文娟，吳效?/p>

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 3. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

微小RNA(microRNA, miRNA)是長度為22～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，通過與靶mRNA的3’-非翻譯端結合在轉錄后水平上調節(jié)基因的表達，其主要作用是降解靶mRNA或抑制其翻譯[1]。miRNA作為轉錄后調節(jié)子在細胞增殖、分化、、凋亡及腫瘤發(fā)生等生物學過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。在女性生殖方面，miRNA也逐步作為重要的分子生物標志物用于評估卵巢功能胎盤功能、子宮內膜容受性、妊娠檢測、胚胎發(fā)育以及妊娠并發(fā)癥[2]。

1 miRNAs在卵巢中的作用

miRNA是卵巢中表達最豐富的小RNA，參與卵泡發(fā)育的全過程，包括卵泡的生長、閉鎖和排卵。在卵泡發(fā)育的不同階段，miRNAs發(fā)揮重要的調節(jié)作用。在不同物種的卵巢、卵泡、卵丘細胞、卵丘-卵母細胞復合體以及黃體中均研究了miRNAs的表達情況[3]。

1.1 miRNAs在顆粒細胞的作用

miR-143存在于小鼠初級卵泡、次級卵泡和竇卵泡的顆粒細胞中。通過轉染miR-143抑制劑發(fā)現，miR-143沉默能顯著增加雌激素的產生和類固醇合成相關基因的表達。體內和體外研究均表明促卵泡激素( follicle stimulating hormone，FSH)能夠明顯降低miR-143的表達，證實miR-143在FSH介導的雌激素合成以及顆粒細胞增殖中發(fā)揮重要作用[4]。

卵母細胞周圍顆粒細胞的凋亡是引起卵泡閉鎖的主要原因，而卵泡的加速閉鎖可能引起女性生育力下降和卵巢早衰，從而導致不孕[5]。雖然卵泡閉鎖的分子機制仍不明確，但研究發(fā)現一些miRNAs能通過其靶基因和不同的信號通路調控卵泡閉鎖。去乙酰化酶1(sirtuin-1，SIRT1)是小鼠卵巢顆粒細胞miR-22的靶向基因，miR-22通過抑制SIRT1表達來調控顆粒細胞凋亡，從而起到調節(jié)卵泡發(fā)育的作用[6]。Let-7g是let-7miRNA家族重要成員之一，轉化生長因子β受體1(transforming growth factor-β receptor 1，TGFBR1)是豬卵巢顆粒細胞中l(wèi)et-7g新的靶向基因，是TGF-β/SMAD信號通路的重要分子，該信號通路在哺乳動物顆粒細胞增殖和凋亡中發(fā)揮作用。Let-7g的過表達能誘發(fā)體外顆粒細胞凋亡，抑制TGFBR1 mRNA和蛋白質水平以及SMAD3的磷酸化水平，說明let-7g作為表觀遺傳調節(jié)因子通過與TGF-β/SMAD信號通路的雙向負反饋調節(jié)作用參與卵巢顆粒細胞的凋亡及卵泡閉鎖[7]。在人卵巢顆粒細胞中，miR-23a和miR-27a通過FasL-Fas途徑直接靶向SMAD5基因從而促進顆粒細胞的凋亡[8]。

1.2 miRNAs對排卵的影響

miR-200b和miR-429作為miR-200家族成員，能顯著影響雌性小鼠生殖功能。miR-200b和miRNA-429特異性敲除的小鼠表現下丘腦-垂體-卵巢軸缺陷，無法排卵。這兩個miRNAs的敲除使鋅指E盒結合同源盒蛋白1(Zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1)mRNA表達增加。ZEB1蛋白是促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)基因的核抑制因子，能夠抑制LH的轉錄，取消LH峰，從而導致無排卵[9]。后期發(fā)現miR-200b和miR-429在人的排卵過程中也發(fā)揮作用。無排卵的多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)患者血清中miR-200b和miR-429的表達明顯高于自發(fā)排卵的女性。這些結果雖然不能確定miRNAs表達改變是導致無排卵的原因，但提示miRNAs可能作為排卵過程的生物標記物，維持正常的排卵功能[10]。

1.3 miRNAs對黃體的影響

黃體是臨時的內分泌腺，通過分泌孕酮維持正常妊娠。黃體功能不全導致女性不孕，而黃體功能不全的重要因素就是孕酮分泌下降。Drosha是miRNA合成所特有的重要酶，Maalouf等[11]研究發(fā)現Drosha敲除的黃體細胞孕酮合成下降，黃體細胞凋亡增多。認為孕酮的降低可能是由于miRNA直接作用于類固醇合成途徑，或是由于凋亡導致細胞減少所致。從黃體形成到黃體功能達到高峰的這一過程中，miRNAs的表達發(fā)生改變，說明其可能參與黃體的形成。Maalouf等[12]首次研究了妊娠期母體識別階段miRNAs對黃體功能的調節(jié)作用，發(fā)現周期黃體和妊娠黃體中的一些miRNAs表達發(fā)生改變。靶向分析這些miRNAs對應的靶向基因，集中于類固醇激素合成、凋亡和免疫反應調節(jié)路徑，說明在妊娠母體識別過程中，miRNAs表達變化對調節(jié)黃體功能和黃體存活有重要作用。

2 miRNAs和卵巢功能紊亂

2.1 miRNAs與PCOS

PCOS是育齡期女性最常見的內分泌代謝疾病之一。研究認為PCOS是由于類固醇激素合成的調節(jié)異常，特別是卵巢雄激素分泌異常所致。顆粒細胞中miRNAs可能對參與卵泡發(fā)育和卵巢類固醇合成的特定基因有直接的調控作用。Sang等[13]和Roth等[14]分別鑒定了PCOS患者卵泡液上清中的miRNAs，其發(fā)現PCOS組與對照組相比miRNAs表達存在差異。前者研究了與類固醇合成有關的7個miRNAs(miR-132、miR-320、miR-24、miR-520c-3p、miR-193b、miR-483-5p和miR-222)，其中miR-132、miR-320、miR-520c-3p和miR-222調節(jié)雌二醇的濃度，miR-24、miR-193b和miR-483-5p調節(jié)孕酮的濃度。在PCOS組中miR-132和miR-320表達均顯著下降。雖然目前這些miRNAs調節(jié)孕酮和雌二醇表達以及黃體分泌的機制還不清楚，但通過生物信息學分析發(fā)現表達最高的miRNAs靶基因與生殖、內分泌和代謝過程均有關。后者的研究發(fā)現5個miRNAs(hsa-miR-9、hsa-miR-18b、hsa-miR-32、hsa-miR-34c和hsa-miR-135a)在PCOS組明顯過表達。PCOS組中3個miRNAs靶基因表達顯著下降，包括胰島素受體底物-2、突觸-1和白細胞介素-8。這3個靶基因的功能都與PCOS表型有關，包括碳水化合物代謝作用、β細胞功能、細胞與細胞間的連接以及類固醇合成。此外，PCOS患者卵丘細胞中miR-483-5p和miR-486-5p表達下降，其靶基因細胞因子信號轉導抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)、血清反應因子(serum response factor，SRF)、第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)和叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1，FOXO1)明顯增加，miR-483-5p的宿主基因胰島素樣生長因子顯著下降，表明miR-483-5p可能對降低胰島素抵抗發(fā)揮重要作用，通過激活PI3K/Akt促進卵丘細胞增殖[15]。這些miRNAs及其靶向基因在卵丘細胞中的差異表達可能解釋了PCOS女性卵泡發(fā)育異常和不孕的原因。

2.2 miRNAs與卵巢早衰

卵巢早衰指40歲前卵巢功能缺失，導致閉經、雌激素過少、促性腺激素升高，是引起不孕的主要因素。有研究認為，卵巢早衰可能是由于卵巢發(fā)育過程中形成的卵泡數降低或是卵泡丟失率增加導致。卵巢顆粒細胞凋亡被認為是卵巢早衰的重要因素，了解其調控機制對卵巢早衰的治療十分重要。miRNA微陣列分析發(fā)現卵巢早衰患者血漿中的miRNAs表達發(fā)生改變，其中10個miRNAs( miR-202、miR-146a、miR-125b-2、miR-139-3p、miR-654-5p、miR-27a、miR-765、miR-23a、miR-342-3p和miR-126)在卵巢早衰患者中的表達升高，2個miRNAs(let-7c和miR-144)表達降低[16]。在人卵巢顆粒細胞中，miR-146a通過與靶向基因白介素-1受體相關激酶-1( interleukin-1 receptor associated kinases-1，IRAK-1)和腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)的作用來調節(jié)顆粒細胞凋亡，其上調誘發(fā)顆粒細胞凋亡，其下調則減少顆粒細胞凋亡[17]。通過研究大鼠卵巢早衰模型miRNAs表達變化揭示了miRNAs在卵巢早衰發(fā)生中的分子作用，其中63個miRNAs的表達被上調，20個miRNAs被下調[18]。這些miRNAs的研究結果為臨床治療卵巢早衰等疑難性不孕疾病提供了新的治療方向，不同物種中miRNAs在卵巢功能中的作用見表1。

表1不同物種中miRNAs在卵巢功能中的作用

Table 1 Function of miRNAs on ovary in different species

表達部位物種作用顆粒細胞小鼠激素合成、顆粒細胞增殖[4]顆粒細胞小鼠顆粒細胞凋亡[6]顆粒細胞豬顆粒細胞凋亡[7]顆粒細胞人顆粒細胞凋亡[8]垂體、血清小鼠、人排卵[9-10]黃體細胞牛黃體細胞凋亡[11-12]卵泡液人類固醇合成[13-14]卵丘細胞人卵泡發(fā)育[15]血漿人顆粒細胞凋亡[16]顆粒細胞人顆粒細胞凋亡[17]卵巢大鼠顆粒細胞凋亡[18]

3 miRNAs對子宮內膜容受性的影響

胚胎成功著床依賴于胚胎質量、胚胎與子宮內膜的相互作用以及子宮內膜的容受性，幾乎多數著床失敗是由于子宮內膜容受性差所致。子宮內膜基質細胞蛻膜化受損容易發(fā)生延遲著床，引起早期妊娠失敗。因此，基于子宮內膜在著床中的重要作用，進一步了解子宮內膜容受性及其作用機制十分重要。到目前為止，還未出現有效的診斷工具用于準確預測子宮內膜容受性[19]。研究發(fā)現一些特定的miRNAs與子宮內膜容受性和子宮蛻膜反應有關。利用miRNA芯片對子宮內膜容受性進行的研究通常分為兩類：一是比較育齡期女性增殖期到著床期子宮內膜基因組的動態(tài)表達；二是研究生育和不孕女性基因組的表達變化。Kresowik等[20]篩選育齡女性正常月經周期增殖期和分泌期子宮內膜組織和血清中miRNAs的表達。發(fā)現一些miRNAs在子宮內膜組織分泌期的表達顯著增加，其中miR-31還存在于血清中，認為miR-31可能通過免疫抑制機制作為子宮內膜容受性最佳的生物標志物。在小鼠及人的內膜組織中，容受期前和容受期的miRNAs表達發(fā)生改變[21]。miRNA家族包括let-7、miR-30、miR-200、miR-17-92以及miR-494和miR-923均被推測能夠調節(jié)并促進子宮內膜容受性相關基因的表達[21-22]。研究證實，圍著床期子宮內膜-胚胎之間的相互作用受miRNAs的調節(jié)，這些miRNAs存在于子宮內膜或胚胎分泌的多泡體中，提示miRNAs可能在胚胎著床過程中發(fā)揮作用[23]。

4研究展望

miRNAs在體液和組織中豐富而穩(wěn)定，作為微創(chuàng)診斷生物標記物具有更廣闊的前景，比當下的診斷標記物更敏感更特異。由于miRNAs具有高度的保守性，能很大程度上保持臨床樣本的完整性，調控生殖疾病的分子表型，評估和監(jiān)測機體的病理生理狀態(tài)，已經逐漸作為新的生物標記物應用于轉化醫(yī)學的臨床診斷中。自首次報道m(xù)iRNAs可以作為癌癥的生物標記物以來，大量研究已經發(fā)現血清/血漿miRNAs的表達隨著生理或病理條件的改變發(fā)生顯著變化。通過血清miRNAs高通量檢測篩選出表達差異顯著的miRNAs，可作為標記物用以區(qū)分PCOS患者和對照組[24]。雖然血清miRNAs可作為評估卵巢功能的生物標記物，但PCOS卵巢組織上表達差異的大多數miRNAs并不能釋放到血液中，從而無法在血清中檢測到[25]。在未來研究中，還要進一步探討miRNAs作為女性生殖體統(tǒng)的潛在生物標記物的作用，為確定卵巢儲備能力，卵巢內分泌功能，評估促排卵藥物的有效性以及胚胎著床的過程提供更多生物信息。此外，miRNAs有望提升生殖系統(tǒng)疾病早期診斷的價值，加速個性化治療的應用前景，從而解決生殖醫(yī)學中不斷增多的生育問題。