周廣銀

(山東省臨沂市蘭山區(qū)人民醫(yī)院，山東 臨沂 276002)

卵巢畸胎瘤是常見的卵巢生殖細(xì)胞腫瘤，占全部卵巢腫瘤的20%左右，占生殖細(xì)胞腫瘤的80%以上，多發(fā)生于育齡期婦女[1]。根據(jù)其成熟程度可分為成熟性、交界性及未成熟卵巢畸胎瘤，其中交界性及未成熟卵巢畸胎瘤具有惡性傾向，對(duì)患者的生命健康造成極大危害。鋅指蛋白2(Zinc finger protein2，Snail2)近年被發(fā)現(xiàn)參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等[2]?；诖?，本研究擬通過檢測(cè)Snail2在不同分化程度的卵巢畸胎瘤中的表達(dá)，并分析與患者臨床資料間的相關(guān)性，從而明確Snail2與卵巢畸胎瘤的關(guān)系，以期為揭示卵巢畸胎瘤惡變機(jī)制及臨床診治工作提供新的線索。

1材料與方法

1.1臨床資料

臨床選取山東省臨沂市蘭山區(qū)人民醫(yī)院2011年5月至2016年9月收治的98例初發(fā)初治的卵巢畸胎瘤患者，病例均經(jīng)過術(shù)中或術(shù)后病理檢查確診，且不合并其他器質(zhì)性疾病及惡性腫瘤。其中成熟卵巢畸胎瘤患者76例，患者年齡19～41歲，平均(27.3±9.2)歲，體重45.5～82.7kg，平均(58.2±10.3kg)；身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)16.3～32.6kg/m2，平均(21.7±4.4)kg/m2。交界性卵巢畸胎瘤患者13例；患者年齡22～43歲，平均(28.5±11.1)歲，體重51.3～77.6kg，平均(61.2±11.9)kg；BMI 16.8～33.1kg/m2，平均(23.0±6.3)kg/m2。未成熟畸胎瘤患者9例；患者年齡22～37歲，平均(28.3±12.8)歲；體重47.8～75.2kg，平均(60.3±14.1)kg；BMI 15.7～31.4 kg/m2，平均(20.4±6.8)kg/m2。三組患者年齡、體重及BMI指數(shù)之間均無顯著差異(均P>0.05)，具有可比性。未成熟畸胎瘤患者的TNM分期以2013年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(The International Federation of Gynecology and Obst￣etrics，F(xiàn)IGO)發(fā)布的《FIGO 2013卵巢癌、輸卵管癌、腹膜癌分期》為標(biāo)準(zhǔn)[3]，Ⅰ期3例(33.33%)，Ⅱ期2例(22.22%)，Ⅲ期4例(44.44%)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：Applied Biosystems 7500 Real-time PCR儀，Bio-Rad S1000 PCR 基因擴(kuò)增儀，NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)，Eppendorf 5424r離心機(jī)，Eppendorf移液器及對(duì)應(yīng)的Axygen Brand Products加樣吸頭，Axygen Brand Products 1.5mL離心管等。主要實(shí)驗(yàn)試劑包括：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司的氯仿、無水乙醇、異丙醇，Thermo Fisher Scientific公司的TRIzol，F(xiàn)ermentas的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及Bio-Rad SYBR Green定量PCR試劑盒。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

手術(shù)取出腫瘤后組織送至病檢，留20mg組織-80℃保存，抽提RNA時(shí)在組織中加入1mL TRIzol，并在冰上裂解，裂解過程中眼科剪盡量剪碎組織，5分鐘后12 000g 4℃離心5分鐘，收集上清液至準(zhǔn)備好的新離心管中，加入200μL氯仿，震蕩混勻后靜置5分鐘，12 000g 4℃離心15分鐘，收集上清液至準(zhǔn)備好的新離心管中，加入1mL異丙醇，室溫靜置10分鐘，去上清后75%乙醇清洗沉淀，7 500 g 4℃離心5分鐘，盡量吸去上清，室溫下風(fēng)干后20μL ddH2O稀釋。超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，取1μg行逆轉(zhuǎn)錄，所有反應(yīng)在冰上進(jìn)行操作，將混合好的反應(yīng)液1以3μL/孔加入八連管中，加無核酶水至10μL；42℃，配置反應(yīng)液2，無核酶水定容至20μL；37℃，15分鐘后85℃ 5秒，得到的cDNA稀釋至500μL。Cyber Green熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系檢測(cè)基因表達(dá)水平。反應(yīng)條件：預(yù)變性 94℃4min，擴(kuò)增條件 94℃ 30秒，60℃ 1 分鐘，40個(gè)循環(huán)。引物情況見表1，內(nèi)參基因β-actin產(chǎn)物長(zhǎng)度286bp，Snail2產(chǎn)物長(zhǎng)度249bp。

表1熒光定量引物

Table 1 Fluorescent quantitative primers

Name of primerSequence (5'-3')Snail2(F)GACGCAATCAATGTTTACTCSnail2(R)TAAAGATAATCCTTTCCATGβ-actin(F)CTCCATCCTGGCCTCGCTGTβ-actin(R)GCTGTCACCTTCACCGTTCC

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1卵巢畸胎瘤組織中Snail2 mRNA的表達(dá)

成熟卵巢畸胎瘤組織相對(duì)表達(dá)量為0.072±0.027，顯著低于交界性瘤0.132±0.049和未成熟卵巢畸胎瘤組織0.171±0.036，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.380，Q值分別為5.408、8.335，P<0.05)，交界性與未成熟卵巢畸胎瘤組織Snail2表達(dá)無顯著性差異(Q=2.261，P>0.05)，見圖1。

圖1患者臨床樣本中Snail2 mRNA的表達(dá)水平

Fig.1 The expression levels of Snail2 mRNA in clinical samples of patients

2.2卵巢畸胎瘤組織中Snail2的表達(dá)與患者年齡、體重、BMI及腫瘤大小的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示Snail2 mRNA的表達(dá)水平與患者年齡、體重及BMI的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，與患者腫瘤大小有顯著正相關(guān)性(P<0.001)，見表2。

2.3卵巢畸胎瘤組織中Snail2的表達(dá)與患者TNM分期的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示Snail2 mRNA的表達(dá)水平與患者TNM分期存在顯著正相關(guān)性(rs=0.589，P<0.05)。

表2卵巢畸胎瘤組織Snail2表達(dá)水平與患者一般資料的相關(guān)性

Table 2 The correlation between the expression levels of Snail2 in ovarian teratoma and general data of patients

Snail2表達(dá)水平年齡體重BMI腫瘤大小rs0.106-0.173-0.2480.625P0.3670.2400.136<0.001

3討論

3.1 Snail2在惡性腫瘤中的表達(dá)及其生物學(xué)意義

Snail2基因位于染色體8q11.21上，其編碼的鋅指轉(zhuǎn)錄蛋白Snail2廣泛分布于體內(nèi)各組織，在正常機(jī)體內(nèi)參與神經(jīng)嵴細(xì)胞的產(chǎn)生和遷移[4]。近年許多研究指出，Snail2參與多種腫瘤的惡變及進(jìn)展過程：①Snail2在惡性程度較高的基底細(xì)胞樣型乳腺癌中高表達(dá)，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)進(jìn)程，并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞干性的維持，加深細(xì)胞的惡性程度[5]；②Snail2同樣可促進(jìn)肺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程及干性轉(zhuǎn)化，并可促腫瘤細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移能力[6]；③Snail2可促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT進(jìn)程，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移能力；④Snail2可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的增殖侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞放療抵抗的形成[7]；⑤Snail2還可抑制前列腺癌細(xì)胞中抑癌基因PTEN的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖及侵襲，并可通過激活CXCR4/CXCL12信號(hào)通路維持前列腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性[8]；⑥Snail2也被發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中高表達(dá)，且促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞EMT進(jìn)程[9]。

3.2 Snail2在惡性腫瘤中的臨床意義

Snail2在臨床水平也被發(fā)現(xiàn)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)：①Snail2與乳腺癌患者TNM分期及不良預(yù)后呈正相關(guān)[5]；②非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織高表達(dá)Snail2提示患者預(yù)后不良[6]；③Snail2的高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后也呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)[10]；④Snail2還可促進(jìn)前列腺癌去勢(shì)抵抗的形成，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[11]；⑤同樣在宮頸癌中發(fā)現(xiàn)Snail2的表達(dá)與患者腫瘤組織的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、浸潤(rùn)深度、FIGO分期及預(yù)后均顯著相關(guān)[9]，以上結(jié)果均提示Snail2的對(duì)惡性腫瘤進(jìn)展的促進(jìn)作用。

3.3 Snail2在卵巢畸胎瘤中的表達(dá)及其臨床意義

本研究檢測(cè)了不同惡性程度卵巢畸胎瘤中Snail2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，分化較好的成熟卵巢畸胎瘤組織Snail2的表達(dá)顯著低于分化較差的交界性及未成熟卵巢畸胎瘤(P<0.05)，提示Snail2對(duì)于卵巢畸胎瘤惡性轉(zhuǎn)變過程中可能發(fā)揮重要作用，但交界性卵巢畸胎瘤與未成熟卵巢畸胎瘤Snail2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，推測(cè)可能是由于樣本量不足所致。相關(guān)性分析結(jié)果顯示Snail2與患者腫瘤大小及未成熟卵巢畸胎瘤TNM分期呈顯著的正相關(guān)性(P<0.05)，提示Snail2對(duì)卵巢畸胎瘤的增殖及惡性進(jìn)展存在明顯的促進(jìn)作用。結(jié)合Kaplan-meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=ovar)資料顯示的1 306例卵巢癌患者的生存率與Snail2表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示高表達(dá)組卵巢癌患者的生存時(shí)間明顯少于低表達(dá)組(P=0.039)，提示Snail2高表達(dá)患者預(yù)后不良，見圖2。

圖2卵巢癌患者的生存率與Snail2表達(dá)水平的相關(guān)性

Fig. 2 Correlation between the survival rate of ovarian cancer and the expression level of Snail2

綜上所述，可以認(rèn)為Snail2在卵巢畸胎瘤中發(fā)揮促癌作用。在進(jìn)一步的研究中將繼續(xù)擴(kuò)大臨床樣本量，并通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)Snail2與卵巢畸胎瘤的關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，探究其對(duì)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、增殖、轉(zhuǎn)移及EMT進(jìn)程的影響，并探索其可能的相互作用分子，揭示Snail2引起卵巢畸胎瘤惡變的確切機(jī)制，為臨床診治工作的奠定基礎(chǔ)。