向琴，高柳，車振明，劉平，林俊帆，李之友

(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)

花椒油(pepper oil)是從花椒中提取呈香、呈味物質于食用植物油中混合均勻的產品，與食用油類似，易受氧、水、光、熱、微生物等的影響而發(fā)生水解或氧化酸敗，產生異臭和異味，嚴重的甚至形成有毒物對人體造成危害[1]。目前，通常采用感官評價和理化檢測(如酸值、過氧化值測定)來辨別花椒油的氧化變質。感官評價法直觀、易實施、無需成本，但主觀性較強、誤差較大、重復性也較差[2]；理化檢測法準確度較高、成本也較低，但耗時較長、需專業(yè)檢測人員。故而，找到一種簡便、準確度高、省時省力的檢測方法迫在眉睫，同時有助于促進花椒油市場的規(guī)范化。而電子鼻是一種快速有效的檢測方式，具有客觀性強、測定速度快、操作簡單、重現(xiàn)性良好、樣品無需復雜前處理等優(yōu)點。利用電子鼻既能分析痕量氣味物質，對樣品間氣味相似度進行簡單比較；也能通過預先采集標準樣品建立相應數(shù)據(jù)庫，進而對未知樣品進行預測和評判，尤其對氣味成分復雜或存在氣味協(xié)同作用的樣品具有良好的監(jiān)測作用。目前，電子鼻技術已經廣泛應用于傳統(tǒng)醫(yī)藥、食品和農產品，尤其在質量評價[3-4]、霉變研究[5]、產地及種類鑒別[6-8]、真?zhèn)舞b別[9-10]、等級鑒定[11-12]、食品過程監(jiān)控[13-14]、不同處理時間或條件下的成熟過程[15-17 ]或貯藏效果[18-23]等方面研究較多。

本研究以市場上較常見的10種花椒油為研究對象，采用電子鼻技術測定花椒油的氣味變化，同時結合聚類分析(CA)、主成分分析(PCA)、線性判別分析(LDA)和判別因子分析(DFA)對不同氧化程度的花椒油進行定性判別分析，并建立花椒油氧化的快速判別模型，同時檢測判別結果與理化指標進行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川老匯花椒油，四川高福記食品有限公司；幺麻子藤椒油，四川洪雅縣幺麻子食品有限公司；五豐黎紅花椒油，四川五豐黎紅食品有限公司；建華花椒油，四川成都建華食品有限公司；牛市破花椒油，四川省漢源大自然有限公司；九斗碗特麻花椒油，成都寶陽味業(yè)有限責任公司；陳麻婆藤椒油，成都陳麻婆川菜調味品有限公司；金龍魚花椒油，嘉里糧油四川有限公司；長康花椒油，湖南省長康實業(yè)有限責任公司；濤胖花椒油，洪雅縣興江食品專業(yè)合作社。以上油樣基本涵蓋四川地區(qū)常見的花椒油種類，且生產日期均控制在距離實驗日期10 d范圍內，保證了油脂的新鮮程度。

三氯甲烷、冰乙酸、KI、Na2SO3、可溶性淀粉、異丙醇、乙醚、百里香酚酞與NaOH(均為分析純),成都科龍試劑化工廠。

1.2 儀器與設備

PEN3電子鼻，德國Airsense公司，傳感器陣列是由10個不同的金屬氧化物傳感器組成[24-25]，見表1，不同傳感器響應不同氣味物質。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

取10種花椒油油樣，置于105 ℃烘箱中進行快速氧化1.5 h[26]，并采用國標法對處理后的樣品進行酸值和過氧化值的測定，根據(jù)測定結果將樣品明確地分為已氧化和未氧化2個階段，共得到50個不同氧化程度的的樣品。

1.3.2 氧化程度指標測定

為確定花椒油樣品的氧化程度，采用GB5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》[27]和GB5009.229—2016《食品中酸價的測定》[28]對花椒油樣品的過氧化值和酸值進行測定。根據(jù)GB 2716—2005《食用植物油衛(wèi)生標準》[29]的規(guī)定，花椒油氧化標準如下：未氧化油的過氧化值≤0.25 g/100 g且酸值≤3 mg/g；氧化油的過氧化值>0.25 g/100 g或酸值>3.00 mg/g。

1.3.3 氣體采集及測定條件

1.3.3.1 分析條件的選擇

對比分析不同水浴溫度和水浴平衡時間對傳感器響應強度的影響，選取新鮮川老匯花椒油樣品(樣品1)為實驗對象，準確量取3 mL置于50 mL樣品瓶中，立即蓋上瓶蓋，水浴平衡一段時間后進行電子鼻分析，平衡溫度梯度25、35、45、55 ℃，平衡時間梯度2、4、6、8 min，每個梯度平行測定5次。

1.3.3.2 氣體采集

準確量取樣品3 mL于50 mL樣品瓶中，根據(jù)1.3.3.1中優(yōu)化的分析條件，采用頂空吸氣法，直接將進樣針頭插入樣品瓶，完成一次檢測后待系統(tǒng)進行清零和標準化，然后再進行第2次頂空采樣，每個樣品平行測定5次。

1.3.3.3 電子鼻檢測條件

樣品準備時間5 s，檢測時間200 s，測量計數(shù)1 s，自動調零時間5 s，清洗時間100 s，內部流量400 mL/min，進樣流量8 mL/min。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

對傳感器采集的原始數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用Alpha-so 軟件和SPSS 20.0提供的CA、PCA、LDA、ANOVA等多種方法進行數(shù)據(jù)處理，建立花椒油氧化與否的快速判別模型，并利用DFA法對未知樣品進行快速判別。

2 結果與分析

2.1 樣品氧化程度分布結果分析

根據(jù)1.3.2中國標對100組模型集樣品以及40組驗證集樣品的過氧化值和酸值進行測定，氧化程度如表2所示。

表2 樣品氧化程度分布Table 2 Distribution of oxidation degree in sample

根據(jù)GB 2716—2005的規(guī)定，當過氧化值>0.25 g/100 g或酸值>3.00 mg/g時則判定樣品發(fā)生氧化。由表2可知，當樣品過氧化值處于0.25～0.35 g/100g時，其酸值<3.00 mg/g，即以過氧化值為判定依據(jù)則樣品處于氧化狀態(tài)，而以酸值為判定依據(jù)則樣品仍處于非氧化狀態(tài)。由此可知，采用過氧化值這個指標來判定花椒油氧化較為嚴格，因此，本實驗以過氧化值為主、酸值為輔來判定樣品的氧化程度。

2.2 氣體采集條件分析

根據(jù)1.3.3.1測定結果，得到不同水浴溫度、不同水浴平衡時間的電子鼻傳感器響應如圖1、圖2所示。

石愛華等[30]對花椒油中的化學成分進行GC-MS分析，結果表明,花椒油中的揮發(fā)性成分多為烯烴、醇類等分子質量較小的化合物，還包括少量的酯類、醇類、酮類化合物，它們在常溫下易揮發(fā)，如α-水芹烯、2-蒎烯、檜烯、β-月桂烯、大根香葉烯、α-檸檬烯、萜品油烯、別羅勒烯、β-欖香烯、芳樟醇、4-萜烯醇、乙酸芳樟酯、乙酸苯乙酯、 4-甲基-2-戊酮等。

圖1 不同溫度下電子鼻的傳感器響應(樣品1)Fig.1 Sensor responses of E-nose at different temperatures (sample 1)

圖2 不同平衡時間下電子鼻的傳感器響應(樣品1)Fig.2 Sensor responses of E-nose under different equilibrium time(sample 1)

由圖1可知，隨著樣品平衡溫度的上升，R1、R3、R4、R5、R8和R10傳感器響應強度幾乎相等，R2、R6、R7和R9傳感器響應強度緩慢上升，且45 ℃下的傳感器響應強度和55 ℃下得傳感器強度幾乎相等，這與石愛華的研究結論相符，但45 ℃下的傳感器響應強度的誤差遠小于55 ℃，說明45 ℃條件下樣品頂空氣體的穩(wěn)定性更好，實驗的重現(xiàn)性更好，平行組樣品強度響應值差異也較小，故本實驗選擇水浴平衡溫度為45 ℃。

由圖2可知，隨著水浴平衡時間的增長，各傳感器響應強度的差異并不明顯，基本接近，故主要考慮測定的穩(wěn)定性，當平衡時間為4 min時，傳感器響應強度的誤差最小，故本實驗選擇水浴平衡時間為4 min。

2.3 樣品傳感器信號分析

隨機抽取川老匯的氧化油樣與未氧化油樣進行電子鼻特征分析，得到相應的傳感器信號響應強度如圖3、圖4所示。

圖3 未氧化花椒油傳感器響應強度Fig.3 Sensor responses intensity of non-oxidized pepper oil

圖4 氧化花椒油傳感器響應強度Fig.4 Sensor responses intensity of oxidized pepper oil

圖3、圖4中每條曲線代表各傳感器對該樣品揮發(fā)性成分的相對電導率隨時間的變化情況，相對電導率值越偏離1(大于或者小于1)，表明響應氣體質量濃度越大；如果質量濃度低于檢測限或未感應到氣體，相對電導率則接近于1[26]。由圖3和圖4可知，進樣后，揮發(fā)性成分被傳感器吸附，相對電導率隨之發(fā)生改變，電子鼻10 個傳感器的響應值先逐漸上升，然后趨于平穩(wěn)，并在140 s后基本達到穩(wěn)定狀態(tài)，因此實驗選取141～145 s內的平均響應值作為特征值分析。

不同傳感器對油樣的響應強度不同，R2、R6、R7和R10傳感器的響應較大，其余傳感器響應較小，說明花椒油中的主要揮發(fā)性成分為氮氧化合物、烷烴類以及含硫化合物。對比氧化油樣與未氧化油樣的響應信號，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在顯著差異：R7傳感器對2種油樣的響應強度均較高，且未氧化花椒油的響應值更高；在R2傳感器上氧化油樣的響應強度明顯高于未氧化油樣，而在R10傳感器上的強度明顯低于未氧化油樣，由此說明氧化油樣與未氧化油樣的揮發(fā)性成分存在顯著差異，可以利用電子鼻進行區(qū)分。

2.4 CA分析

在解決實際問題過程中，對多個樣本進行分類時，依據(jù)單因素分類往往不夠全面、綜合的描述其類別，因此需考慮多方面因素進行分類。CA分析是一種對研究對象或指標的諸多特性進行分類的方法，它將樣品按照某種特性的相似程度逐漸聚合在一起，相似度最大的優(yōu)先聚合在一起，最終按照類別的綜合性質多個品種聚合，從而完成聚類分析的過程[31]。

本研究選取10個傳感器141～145 s內響應強度的平均值為特征值進行分析，將所有數(shù)據(jù)點輸入SPSS 20.0，采用離差平方和法(Ward法)進行系統(tǒng)聚類分析，并以平方歐氏距離為度量標準[26]對模型集中100個實驗油樣進行CA分析，得到樹狀圖如圖5所示。

圖5 氧化與未氧化花椒油揮發(fā)性物質聚類分析(CA)Fig.5 Clustering analysis of volatile compounds in oxidized and non-oxidized pepper oils

最小距離水平上，所有樣品總共形成了5個小類，每一小類所包含的樣品之間具有極大的相似性。隨著歐式距離的增大，第2小類和第3小類繼續(xù)聚為一類，第4小類和第5小類繼續(xù)聚為一類。當歐氏距離增至5時，第1小類才聚入第2小類、第3小類，說明第1小類所包含的樣品與第2小類、第3小類所包含的樣品在揮發(fā)性風味特性上具有一定的相似性，而與第4小類和第5小類所包含樣品相似性較差。由圖5可明顯看出，100個模型集樣品明顯聚為兩類，對比樣品國標法所測得的過氧化值和酸值，聚類結果與國標法測定結果相一致。由此可知，利用電子鼻結合CA分析法可以對花椒油氧化進行判別。

2.5 PCA分析

PCA分析是降低數(shù)據(jù)維度和解決多重共線性問題最常用的多變量統(tǒng)計方法之一。該方法簡化了獲取樣品信息的任務，采用非監(jiān)督式的投影方法，通過對原始變量的不相關和線性組合形成新變量來整合數(shù)據(jù)。通常，這些新變量(稱為主要組件(PC))能夠解釋整個數(shù)據(jù)中絕大多數(shù)變量，即僅考慮幾個新變量就能將高維數(shù)據(jù)以最小的信息損失降低到更低的維度[32]。因此，該法常用于獲取復雜樣品的數(shù)據(jù)信息和對高維度數(shù)據(jù)信息進行降維。

為了更有效地區(qū)分氧化油樣和未氧化油樣，本研究采用降維的PCA分析法對樣品進一步分析以期望達到更好的分離效果。根據(jù)電子鼻響應信號，對10個傳感器的響應值進行主成分分析，結果如圖6所示。

圖6 氧化花椒油與非氧化花椒油樣的主成分分析(PCA)Fig.6 Principal component analysis of oxidized and non-oxidized pepper oils

由圖6可知，PC1的方差貢獻率為92.65%，PC2的方差貢獻率為6.91%，PC1和PC2的總貢獻率達99.561%>85%，說明前2個主成分足以代表油樣的整體信息，PCA分析結果有效。所有樣品被分成兩簇，且兩簇之間明顯區(qū)分開，說明氧化油樣與未氧化油樣的風味差異較大，能夠被電子鼻區(qū)分，區(qū)分結果與國標測定的結果相一致。因此，利用電子鼻結合PCA分析法可以辨別花椒油氧化與否。

2.6 LDA分析

LDA能夠將n維數(shù)據(jù)投影到低維空間，使投影后組與組之間盡可能分開，以最大的組間距離和最小的組內距離為衡量標準來判斷樣品的可分離性[33]。將模型集樣品傳感器在141～145 s的響應平均值作為特征值，通過LDA分析法進行分析，如圖7所示。

圖7 氧化花椒油與未氧化花椒油的線性判別分析(LDA)Fig.7 Linear discriminant analysis of oxidized and non-oxidized pepper oils

由圖7可知，LD1方差貢獻率為47.72%，LD2方差貢獻率為6.61%，總貢獻率達到54.33%。總貢獻率相對較小，但2種油樣的組間差異明顯增大，組內差異明顯減小。通過對驗證集樣品的判別，所有油樣均能成功，因此，LDA分析法也可以作為花椒油氧化與否的判別方式之一。

2.7 DFA分析

DFA分析是一種基于數(shù)據(jù)演繹的分類方法。與PCA分析不同，它是一種監(jiān)督式的分類方法，通過估算不同類別之間的邊界值，使得類別之間的方差最大化，并且各類中的方差最小化。因此，線性組合最大化了這些維度的貢獻，進而使得預測組之間產生最大化的差異，使用該方法可以根據(jù)不同的屬性對同一數(shù)據(jù)集進行不同的分類[32]。

2.7.1 全變量DFA模型分析

將模型集樣品的所有傳感器響應值數(shù)據(jù)進行DFA分析，并建立相應的DFA模型，并對40組驗證集樣品進行隨機編號U1～U40，利用DFA模型進行驗證，若分組結果與國標測定一致，則顯示為yes，否則顯示為no，判別率結果見表3。

表3 驗證集油樣的判別結果Table 3 Identification results of the validation set in pepper oil samples

由表3可知，利用模型集樣品的傳感器響應值進行DFA建模，所建模型對40組未知樣品的識別效果較差，且對未知樣品U2、U8、U15、U19、U24、U30、U33、U37和U40識別錯誤，結合該9種油樣的過氧化值，分別為0.254、0.249、0.251、0.245、0.223、0.255、0.248、0.252、0.246 g/100 g，由此可知利用所有傳感器響應數(shù)據(jù)所建DFA模型對氧化臨界值附近的樣品判別效果較差，因此，有必要對10個傳感器進行優(yōu)化。

2.7.2 傳感器優(yōu)化DFA分析

方差分析(ANOVA分析)，又稱“變異數(shù)分析”或“F檢驗”，是用于2個及2個以上樣本均數(shù)差別的顯著性檢驗，方差分析的目標為經過數(shù)據(jù)分析判斷敏感因素、因素間的相互影響以及敏感因素的最佳值等[34]，其結果常以F值和p值的大小來表示。與給定顯著水平的標準F值相比較，若F值越大，說明處理之間效果或差異越明顯；若F值越小，說明試驗精度越高。

以模型集20組樣品(每組樣品5次平行)的傳感器響應值為研究對象，利用SPSS 20.0進行單因素方差分析(ANOVA)來優(yōu)選傳感器，結果見表4。最終選擇F值>120的傳感器為DFA建模的最優(yōu)傳感器，即以W5S、W1W、W2W和W3S等4根傳感器為優(yōu)選傳感器。

表4 傳感器響應方差分析結果Table 4 Variance analysis results of the sensor respondsin pepper oil samples

利用以上述優(yōu)選傳感器重新對模型集樣品進行DFA分析，并以2.7.1中識別錯誤的9個樣品以及隨機抽取的1個樣品作為驗證集，依次編號XU1～XU10，并對新建模型進行驗證，結果見表5。

表5 10個未知樣品的判別結果Table 5 Identification results of 10 unknown pepper oilsamples

由表5可知，采用優(yōu)選傳感器建立的DFA模型，10個未知樣本均落在相應的組別，判別效果良好，判別正確率均大于96%。因此，利用電子鼻的優(yōu)選傳感器結合DFA法能夠有效判別花椒油樣品氧化與否，且可行性較高。

2.8 模型驗證結果

為了進一步驗證本實驗所建花椒油氧化快速模型的可靠性，利用CA、PCA、LDA和DFA所建模型對未參與建模的40個驗證樣品進行判別分析，并計算判別正確率：判別正確率=判斷正確個數(shù)÷總的判斷次數(shù)，其結果見表6。

表6 盲樣的CA、PCA、LDA和DFA的驗證結果Table 6 Validation results of CA，PCA，LDA and DFA inunknown pepper oil samples

由表6可知，當40組驗證樣品經CA時，有1個未氧化和1個已氧化錯誤，與國標方法判定結果不一致，對應的過氧化值分別為0.230、0.270 g/100 g，均在臨界值附近，與標準相差較??；經PCA時，僅有1個未氧化樣品錯誤，其過氧化值為0.24 g/100 g，處于未氧化狀態(tài)，造成錯誤的原因在于接近氧化臨界值(0.25 g/100 g)較接近，使得模型誤判；經LDA時，所有驗證集樣品均正確，與國標判定結果一致；經DFA時，有2個未氧化油樣和1個已氧化油樣錯誤，與國標判定結果不一致。

綜上所述，電子鼻技術結合CA、PCA、LDA和DFA分析法基本能有效花椒油氧化與否，且LDA法的效果最穩(wěn)定，能夠有效地避免主觀因素對結果的影響，同時克服了傳統(tǒng)理化方法的缺點，達到了快速檢測的目的。

3 結論

利用電子鼻技術對花椒油的氣味成分進行了分析，確定了花椒油中的揮發(fā)性物質主要為氮氧化合物、烷烴類以及含硫化合物等。結合CA、PCA、LDA、DFA等分析方法建立了花椒油氧化的快速模型，并對模型進行了驗證，判別正確率分別為95.0%、97.25%、100%，97.50%。因此，CA、PCA、LDA、DFA分析法均能有效花椒油氧化與否，且LDA法效果較好。