楊根歡，姚榮彥，汪 巖，廖鵬志，賈玉龍*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 血管外科， 北京 100050； 2.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系， 北京 100084)

隨著社會老齡化的進(jìn)展及人民生活水平的提高，動脈硬化閉塞癥的發(fā)病率也越來越高。血管腔內(nèi)成型術(shù)是目前治療動脈硬化閉塞癥的主要手段，但是術(shù)后血管內(nèi)膜的增生會導(dǎo)致管腔的再狹窄， 因

此術(shù)后管腔的再狹窄率高一直是制約其長期療效的瓶頸[1]。褪黑素是一種高效的抗炎性反應(yīng)和抗氧化劑，在人體內(nèi)廣泛分布[2]。已有研究表明褪黑素對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有重要的保護(hù)作用[3]。本研究闡明了褪黑素能夠抑制血管的炎性反應(yīng)，進(jìn)而減輕大鼠頸動脈球囊損傷后的內(nèi)膜增生。

1 材料與方法

1.1 材料

20只SPF級SD大鼠，雄性，平均體質(zhì)量350 g〔北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,合格證號：SCXK(京)20120001〕；2F動脈取栓球囊(Edwards Lifesciences公司)；褪黑素和彈力蛋白染色試劑盒(Sigma-Aldrich公司)；NF-κB抗體(Cell Signaling Technology公司)；IL-1β抗體、IL-6抗體和TNF-α抗體(Boster Biological Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及處理：將20只大鼠隨機(jī)分為對照組(control)、褪黑素組(melatonin；5 mg/kg，每日皮下注射1次)、球囊損傷組(balloon；常規(guī)行頸動脈球囊損傷)和褪黑素干預(yù)組(balloon+melatonin)，每組5只。

1.2.2 彈力蛋白染色檢測內(nèi)膜增生程度：14 d后，將頸動脈在4%多聚甲醛中固定72 h，按照常規(guī)方法制片染色。將彈力蛋白染色切片置于光學(xué)顯微鏡下拍照(×100)。用Image-Pro Plus 6.0軟件測量其內(nèi)膜面積和中膜面積，內(nèi)膜面積與中膜面積的比值(intima/media, i/m)代表血管內(nèi)膜的增生程度，用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 Western blot 檢測NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)：將液氮中保存的頸動脈標(biāo)本加入600 μL SDS組織裂解液并研磨成勻漿，提取組織蛋白后并測定蛋白濃度。將20 μg總蛋白上樣，常規(guī)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，4 ℃一抗孵過夜(NF-κB 1∶2 000；IL-1β 1∶500；IL-6 1∶500；TNF-α 1∶500)，洗膜后室溫下二抗(濃度1∶5 000～1∶10 000)孵育60 min，辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白。Western blot結(jié)果用Alpha EaseFC system 軟件進(jìn)行分析，計(jì)算出目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參的吸光度值比值，用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同處理組大鼠頸動脈i/m值

球囊損傷組頸動脈的i/m值顯著高于對照組(P<0.01)。褪黑素干預(yù)組頸動脈i/m值顯著回降(P<0.01)(圖1)。

A.control; B.melatonin; C.balloon; D.balloon+melatonin;*P<0.01 compared with control;#P<0.01 compared with balloon

圖1不同處理組大鼠頸動脈的彈力蛋白染色和i/m值

2.2 不同處理組大鼠頸動脈內(nèi)NF-κB的表達(dá)

球囊損傷組頸動脈的NF-κB表達(dá)顯著高于對照組(P<0.01)。褪黑素干預(yù)組頸動脈的NF-κB表達(dá)顯著回降(P<0.01)(圖2)。

2.3 不同處理組大鼠頸動脈內(nèi)IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)

球囊損傷組頸動脈的IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)顯著高于對照組(P<0.01)。褪黑素干預(yù)組頸動脈的IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)顯著回降(P<0.05)(圖3)。

3 討論

血管腔內(nèi)成型術(shù)后的內(nèi)膜增生是一個多因素參與的復(fù)雜過程，包括平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移、炎性細(xì)胞的浸潤、血小板的黏附等。已有研究表明炎性反應(yīng)是介導(dǎo)血管內(nèi)膜增生的核心環(huán)節(jié)[5]。血管腔內(nèi)成型術(shù)中血管內(nèi)膜的“二次損傷”是其術(shù)后內(nèi)膜增生的重要始動環(huán)節(jié)[6]。本研究中球囊損傷大鼠的頸動脈便可模擬血管腔內(nèi)成型術(shù)中血管內(nèi)膜的“二次損傷”。褪黑素最早是在松果體中被發(fā)現(xiàn)的，因此也被稱為松果體素。進(jìn)一步的研究表明人體的多種器官組織均可以合成褪黑素，如皮膚、肝臟和消化道等[7]。它具有調(diào)節(jié)人體生理節(jié)律、抗炎性損傷和抗氧化損傷等多種作用[8]。已有研究表明，褪黑素在多種血管相關(guān)性疾病中均具有明顯的保護(hù)作用，如動脈粥樣硬化、高脂血癥、高血壓和低氧相關(guān)的血管損傷等[9-10]。

*P<0.01 compared with control; #P<0.01 compared with balloon圖2 不同處理組大鼠頸動脈NF-κB表達(dá)Fig 2 The expression of NF-κB in carotid arteries treated n=5)

*P<0.01 compared with control; #P<0.05 compared with balloon圖3 不同處理組大鼠頸動脈IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)Fig 3 The expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α in carotid arteries treated n=5)

本研究中,球囊損傷后大鼠頸動脈的i/m值明顯增加，而注射褪黑素后，i/m值明顯降低，這表明褪黑素能夠抑制血管內(nèi)膜的增生。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，球囊損傷能夠明顯誘導(dǎo)大鼠頸動脈中炎性因子NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)，而褪黑素能夠顯著降低這些炎性因子的表達(dá)。這表明炎性反應(yīng)參與了大鼠頸動脈球囊損傷后的內(nèi)膜增生，NF-κB在血管內(nèi)膜增生的過程中可能發(fā)揮重要的作用。炎性因子的表達(dá)是炎性反應(yīng)的一個重要特征，NF-κB是炎性反應(yīng)鏈中重要的上游因子。NF-κB的激活能夠誘導(dǎo)它的一系列下游炎性因子的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致炎性反應(yīng)的不斷放大，稱其為瀑布樣的炎性反應(yīng)。這些下游因子主要包括IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1等[11]。抑制NF-κB的表達(dá)能夠顯著減輕損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜的損傷[12]。本研究尚表明褪黑素可能通過抑制NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)通路，減輕了大鼠頸動脈球囊損傷后的內(nèi)膜增生。褪黑素在預(yù)防血管腔內(nèi)成型術(shù)后管腔的再狹窄上可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。