鄧大煒，吳 斌，嚴(yán) 舒，蘭 川，張光年，曾麗娟，李建水*

(川北醫(yī)學(xué)院 1.肝膽胰腸疾病研究所； 2.附屬醫(yī)院 肝膽外科； 3.附屬醫(yī)院 信息科，四川 南充 637000)

腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cells, TSCs)是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的根源，其比例與腫瘤的惡性程度成正相關(guān)[1-3]。近年來發(fā)現(xiàn)，發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生部分干細(xì)胞特性，同時(shí)腫瘤干細(xì)胞又具有EMT的特征，EMT在腫瘤干細(xì)胞的發(fā)展中扮演重要角色。miRNAs的異常表達(dá)可介導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞的致瘤性、耐藥性與EMT調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[4-6]。研究證實(shí)，miR-145在組織中廣泛存在，在膀胱癌、乳腺癌、腎癌和非小細(xì)胞肺癌中異常低表達(dá)，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7-11]。目前，國內(nèi)外對miR-145在胰腺癌EMT與腫瘤干細(xì)胞中的研究較少。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-145過表達(dá)慢病毒進(jìn)入胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，觀察過表達(dá)miR-145后對PANC-1發(fā)生EMT及腫瘤干細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)(川北醫(yī)學(xué)院肝膽胰腸研究所);RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清(Hyclone公司);miR-145過表達(dá)慢病毒(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司);細(xì)胞總RNA提取試劑盒、PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、SYBY Green染料、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)引物(TaKaRa公司)；Western blot試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、OCT4多克隆一抗、兔抗人GAPDH多克隆抗體一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(生工生物工程公司)。

1.2 材料與方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:將PANC-1細(xì)胞分為：miR-145組(感染miR-145過表達(dá)慢病毒)、對照組(感染陰性對照慢病毒)和空白組(未經(jīng)處理的細(xì)胞)。

1.2.2 慢病毒感染:取對數(shù)期PANC-1細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)40，每孔加入5 μg/mL聚凝胺(polybrene)，24 h后更換完全培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)，72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度及進(jìn)行下一步檢測。

1.2.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn):檢測miR-145組和對照組細(xì)胞黏附能力：取PANC-1和HUVEC 926細(xì)胞懸液各100 μL接種于96孔板內(nèi)除第1、7、12列的A-D、E-H排孔內(nèi)，過夜培養(yǎng)。次日取miR-145組細(xì)胞懸液100 μL/孔加至96孔板第3至7列A-H孔內(nèi)，對照組細(xì)胞懸液100 μL/孔加入第8至12列A-H孔內(nèi)，第1列所有孔內(nèi)均加入100 μL無血清培養(yǎng)基。每隔30 min分別依次輕輕吸出3、8列，4、9列，5、10列，6、11列所有小孔的培養(yǎng)液。以上所有孔均用PBS液洗后加入100 μL無血清的培養(yǎng)基。1 200 r/min離心10 min,離心后 2、7、12列所有小孔處理同前。除D、E排外的所有孔內(nèi)加20 μL MTT，4 h后去上清液,每孔加150 μL二甲亞砜(DMSO)，震蕩均勻后在波長為570 nm下測量A值。計(jì)算干miR-145組同(異)種黏附率=[A同(異)種各時(shí)間點(diǎn)-A2ABC(FGH)]/A7ABC(FGH);對照組同(異)種黏附率=[A同(異)種各時(shí)間點(diǎn)-A2ABC(FGH)]/A12ABC(FGH)，并用熒光顯微鏡觀測D和E排各孔熒光，攝像。

檢測空白組細(xì)胞黏附能力的變化：方法同miR-145組或?qū)φ战M，只需將次日鋪板的細(xì)胞換成空白組PANC-1細(xì)胞。

1.2.4 瘤球形成實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤干細(xì)胞特性:取對數(shù)期PANC-1細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，PBS緩沖液洗滌后無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整為1×104個(gè)/mL,在低吸附6孔培養(yǎng)板中每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)。隔天觀察并拍照留存，每隔3～4 d換液，約10～12 d后培養(yǎng)板中出現(xiàn)懸浮、透亮、折光性強(qiáng)的細(xì)胞球時(shí)拍照、收集腫瘤細(xì)胞備用。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測mRNA的表達(dá):用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測得RNA濃度及純度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用CFX96熱循環(huán)擴(kuò)增儀擴(kuò)增各目的基因，以GAPDH為內(nèi)參(miR-145以U6為內(nèi)參)。miR-145反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACAGGGAT-3′。根據(jù)各目的基因2-△△Ct表示miR-145、E-cadherin、N-cadherin和OCT4 mRNA的相對表達(dá)水平。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。定量引物序列見表1。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)：提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定提取蛋白濃度。行SDS-PAGE凝膠電泳，每孔道蛋白上樣量50 μg，恒流電泳2 h。參照Maker切膠，濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育一抗E-cadherin、N-cadherin、OCT4過夜，次晨復(fù)溫，TBST漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(稀釋比例1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，ECL顯影、保存圖像，用Fusion FX7灰度分析軟件測吸光度值分析吸光度值，結(jié)果以目的蛋白吸光度值與內(nèi)參吸光度值的比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染率達(dá)90%

感染72 h后，對照組與miR-145組PANC-1細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光的表達(dá)。對照組與miR-145組PANC-1細(xì)胞中慢病毒轉(zhuǎn)染效率均達(dá)90%左右(圖1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

圖1 轉(zhuǎn)染72 h后PANC-1細(xì)胞內(nèi)見綠色熒光蛋白表達(dá)Fig 1 Green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope 72 hours after transfection(×200)

2.2 miR-145過表達(dá)慢病毒顯著上調(diào)PANC-1細(xì)胞miR-145 mRNA表達(dá)

miR-145在PANC-1細(xì)胞系中低表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-145過表達(dá)慢病毒后miR-145 mRNA表達(dá)水平較對照組上升(67.22±2.66)倍(P<0.05)(圖2)。

2.3 上調(diào)miR-145改變PANC-1黏附能力

同種黏附實(shí)驗(yàn)中(圖3A、3B)，miR-145組細(xì)胞黏附率高于對照組(P<0.05)(表2)。異種黏附實(shí)驗(yàn)中(圖3C、3D)，miR-145組細(xì)胞黏附率低于對照組(P<0.05)(表3)。

2.4 上調(diào)miR-145降低PANC-1單克隆瘤球形成能力

相對于對照組與空白組，miR-145組PANC-1形成的瘤球更少(P<0.05)，瘤球直徑也更小(P<0.05)，提示上調(diào)miR-145后抑制PANC-1細(xì)胞成瘤能力(圖4)。

2.5 miR-145能調(diào)控E-cadherin、N-cadherin與OCT4 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)

miR-145組的PANC-1 細(xì)胞中E-cadherin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著高于對照組與空白組(P< 0.05)。miR-145組的PANC-1 細(xì)胞中N-cadherin與OCT4 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯低于對照組與空白組(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with control group and blank group圖2 miR-145過表達(dá)慢病毒上調(diào)miR-145的表達(dá)Fig 2 Expression of miR-145 mRNA was increased after transfecting over-expressed lentiviral

A.adhered cells of control group in homogeneous cells intercellular adhesion experiment; B.adhered cells of miR-145 group in homogeneous cells intercellular adhesion experiment; C.adhered cells of miR-145 group in heterologous cells intercellular adhesion experiment; D.adhered cells of control group in heterologous cells intercellular adhesion experiment

圖3 不同處理組PANC-1細(xì)胞同種及異種黏附力

*P<0.05 compared with control group and blank group.

表3 不同處理組PANC-1細(xì)胞異種黏附率Table 3 Heterogeneous cells intercellular rates in PANC-1 cells in various

*P<0.05 compared with control group and blank group.

3 討論

人類大約有30%的蛋白質(zhì)受microRNAs的調(diào)控，其功能參與生長發(fā)育、新陳代謝、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。miRNAs作為重要的基因調(diào)控因子參與腫瘤干細(xì)胞的自我更新、分化、增殖和EMT等過程[4]。miR-145作為抑癌基因在組織中廣泛存在。miR-145可通過調(diào)控腫瘤干細(xì)胞參與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、EMT及耐藥。例如miR-145增加結(jié)腸癌干細(xì)胞對5-氟尿嘧啶與奧沙利鉑的敏感性，減小藥物的不良反應(yīng)，有效的治療結(jié)腸癌復(fù)發(fā)[12]。但miR-145能否調(diào)控胰腺癌發(fā)生EMT及對胰腺癌干細(xì)胞特性的影響尚未有相關(guān)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-145后明顯增加胰腺癌細(xì)胞同種黏附能力，顯著降低了胰腺癌細(xì)胞異種黏附能力及體外成球能力，減弱了腫瘤細(xì)胞干性獲得能力。EMT是細(xì)胞形態(tài)從上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型的過程，伴有細(xì)胞極性消失、運(yùn)動能力增強(qiáng)、黏附能力減弱等現(xiàn)象。其主要分子機(jī)制為“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換”即上皮細(xì)胞分子標(biāo)志物E-cadherin等表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)表型標(biāo)志物N-cadherin等表達(dá)上調(diào)[13]。腫瘤干細(xì)胞主要受干性相關(guān)基因的調(diào)控，其中干性基因OCT4是維持胚胎干細(xì)胞與多功能干細(xì)胞特性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)OCT4也是目前已知最重要的腫瘤干細(xì)胞調(diào)控因子之一[14]。為了探討上調(diào)miR-145后發(fā)生黏附能力改變與腫瘤細(xì)胞干性獲得能力減弱的分子機(jī)制，本研究檢測了細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin與OCT4 的表達(dá)水平， 結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin與OCT4表達(dá)下調(diào)，提示過表達(dá)miR-145后在轉(zhuǎn)錄水平抑制PANC-1細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin與OCT4的表達(dá)。這可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間黏附能力增加，不易從母體脫落，而且脫落的細(xì)胞發(fā)生“阿米巴運(yùn)動”能力減弱，使EMT發(fā)生逆轉(zhuǎn)。同時(shí)，腫瘤的干性調(diào)控基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的干性獲得能力減弱。

A.blank group; B.control group; C.miR-145 group圖4 不同處理組細(xì)胞單克隆瘤球形成能力Fig 4 Spheroid formation capacity in various groups(×40)

*P<0.05 compared with control group and blank group圖5 不同處理組E-cadherin、N-cadherin與OCT4 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)Fig 5 Expressions of E-cadherin,N-cadherin and OCT4 mRNA and proteins in various

綜上所述，上調(diào)miR-145的表達(dá)可以促進(jìn)胰腺癌EMT的逆轉(zhuǎn)，降低胰腺癌腫瘤干細(xì)胞特性獲得，研究結(jié)果為臨床胰腺癌的基因靶向治療提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。