凌 燕，彭詩維，馮紫雯，龔劍紅*

(1.江西省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江西 南昌 330006； 2.南昌縣婦幼保健院 婦產(chǎn)科，江西 南昌 330200)

已有研究顯示，成熟的microRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，影響腫瘤細胞的増殖、遷移、侵襲以及上皮間質(zhì)轉化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)過程[1-2]。宮頸癌是一種比較常見的婦科腫瘤，在女性腫瘤的發(fā)生中，其發(fā)病率排名第二，僅次于乳腺癌。近年來，中國惡性宮頸癌發(fā)病率呈逐年上升，但治愈率比較低，主要原因是其發(fā)病的分子機制不十分清楚。miR-26b在宮頸癌組織中呈現(xiàn)低水平表達[3]，且與一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，如肝癌、腸癌以及膠質(zhì)瘤等[3-5]，然而有關其在宮頸癌疾病的作用及其分子機制尚不清楚。本研究擬將miR-26b mimic轉入人宮頸癌細胞系中，觀察miR-26b對宮頸癌細胞遷移及上皮間質(zhì)轉化的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細胞系HeLa、SiHa、Caski和C33A (中國科學院上海細胞庫)； Trizol和脂質(zhì)體轉染試劑LipofectaminTM2000(Invitrogen公司)； miRNA 26b mimic和無義scramble miRNA(上海吉瑪公司)；反轉錄和熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；E-cadherin和N-cadheri抗體(Cell Signaling Technology公司)；HRP標記的二抗(北京中杉金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉染： 宮頸癌細胞系經(jīng)解凍后，培養(yǎng)于含 10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，細胞增殖至60%～80%匯合時，按說明書進行轉染。實驗分為陰性對照組(僅加入相應劑量的培養(yǎng)液)、scramble miRNA組和miRNA 26b mimic組。

1.2.2 RT-qPCR：按說明書提取總RNA后反轉錄得到cDNA， ABI 7500型PCR儀檢測基因的表達水平。以U6 snRNA作為對照，通過2△△CT法來計算目的基因的表達。miR-26b和U6 snRNA引物參照以前發(fā)表文章[3]。其他基因引物:CXCL14上游引物：5′-GGACGGGTCCAAATGCAA-3′, 下游引物：5′-ACGTCGCTGTAGCGGATCTT-3′； Smad4上游引物：5′-CCCAAGACAGAGCATCAAAGAA-3′, 下游引物：5′-GGGCCCGGTGTAAGTGAAT-3′； TRAF5上游引物：5′-TGGGCCGGTACCAGGAT-3′, 下游引物：5′-TCATTAGAACACTGCACAGGTTGA-3′； EphA2上游引物：5′-CCAGTTCAGCCACCACAACA-3′, 下游引物：5′-CATGGGCTTGTATTTGGAGATG-3′。

1.2.3 細胞劃痕實驗: 將細胞種植于24孔培養(yǎng)板，待細胞增殖至80%～90%時，用20 μL槍頭于底部平行于標記線劃痕，PBS清洗脫落的細胞。然后放入 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在0和24 h拍照，計算劃痕損傷面積愈合率。

1.2.4 Western blot:用RIPA液裂解細胞，16 099×g離心10 min，收集上清液，測定蛋白質(zhì)的濃度，將20 μg蛋白質(zhì)上樣于4%濃縮膠，經(jīng)12%分離膠電泳后，轉膜至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃狀態(tài)下將PVDF膜與一抗孵育過夜。PBS洗膜3次，洗膜后加入二抗，在室溫狀態(tài)下孵育 1 h，最后顯色，通過Quantity One凝膠吸光度分析軟件測定其吸光度值，以actin作為內(nèi)參蛋白。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測實驗: 為了檢測Smad4是否為miR-26b的直接下游靶基因，采用雙熒光素酶報告分析。首先擴增出包含有 miR-26b保守性結合位點3′UTR-WT(野生型) 及3′UTR-MT(突變型)。擴增產(chǎn)物行凝膠電泳，然后將目的基因切膠回收，再將目的基因與質(zhì)粒載體 pmiR-report Luciferase相連接，構建pGL3-Smad4-3′-UTR-WT和pGL3-Smad4-3′-UTR-MT載體，將重組質(zhì)粒和miR-26b mimic共同轉染細胞，最后用雙熒光素酶基因報告檢測儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 4種宮頸癌細胞系中miR-26b mRNA的表達

與正常宮頸上皮細胞相比，miR-26b mRNA在HeLa、SiHa、Caski和C33A 4種宮頸癌細胞系中均為低表達(圖1)，其中以C33A細胞系最為明顯(P<0.01)，故以下實驗選用C33A細胞系作為轉染的細胞模型。

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group圖1 實時定量PCR檢測miR-26b mRNA在4種宮頸癌細胞系的表達Fig 1 Expression of miR-26b mRNA in cervical cancer cell lines by quantitative PCR analysis

2.2 miR-26b mimic成功轉染C33A

miR-26b mimic組中miR-26b mRNA表達水平明顯高于對照組(P<0.01)(圖2)。

*P<0.01 compared with negative control group圖2 實時定量PCR分析miR-26b mRNA在C33A細胞系的表達水平Fig 2 Expression of miR-26b mRNA in C33A cell line by quantitative PCR analysis n=3)

2.3 miR-26b對細胞劃痕遷移的影響

細胞劃痕培養(yǎng)24 h后，轉染miR-26b mimic，C33A細胞的劃痕損傷面積愈合率為30.23%±8.14%，顯著低于對照組的89.71%±6.73%(P<0.01)(圖3)。

2.4 miR-26b對C33A細胞系中EMT標志蛋白表達的影響

轉染48 h 后，與對照組相比，miR-26b mimic組中E-cadherin蛋白的表達水平明顯上升, N-cadherin表達水平明顯下降(P<0.01)(圖4)。

2.5 miR-26b對潛在的靶基因表達水平的影響

轉染24 h后，與對照組相比，miR-26b mimic組中Smad4 mRNA表達水平明顯下降(P<0.01),而CXCL14、TRAF5和EphA2 mRNA表達水平無明顯變化(圖5)。

2.6 上調(diào) miR-26b 表達后雙熒光素酶相對活性的改變

與對照組相比，pGL3-Smad4-3′-UTR-WT與miR-26b mimic共轉染細胞48 h 后，熒光素酶相對活性明顯下降(P<0.01)；而pGL3-Smad4-3′-UTR-MT與miR-26b mimic共轉染組的熒光素酶相對活性無明顯變化(圖6)。

3 討論

在腸癌、肝癌、骨肉瘤及宮頸癌組織中，miR-26b表達水平明顯下降，轉染miR-26b的類似物可明顯抑制腸癌細胞的轉移[3-6]。此外， miR-26b-5p可通過作用于SMAD1蛋白，抑制肝癌細胞遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉化過程[5]。在骨肉瘤細胞中，miR-26b通過下調(diào)PFKFB3的表達，抑制其增殖、遷移和侵潤[6]。這些結果提示，宮頸癌組織中miR-26b表達水平的下降可能增強宮頸癌細胞的轉移能力及EMT的發(fā)生。為了探討miR-26b在宮頸癌組織的發(fā)生和轉移中作用，本研究選用了miR-26b表達水平最低的C33A細胞系作為研究對象，其呈現(xiàn)HPV16陽性，具有較強的侵襲能力。通過轉染miR-26b類似物，可明顯抑制C33A宮頸癌細胞系的遷移和EMT的發(fā)生。因此，正常組織中miR-26b的表達有利于防止腫瘤的形成以及腫瘤細胞的遷移和侵襲的發(fā)生。

圖3 劃痕實驗分析miR-26b對C33A細胞系遷移的影響Fig 3 Effect of miR-26b on the migration of C33A cell line by scratch-wound assay(×100)(scale bar=50 μm)

A.representative immunoblotting images of E-cadherin and N-cadherin; B,C.densitometric values from Western blot analyses of E-cadherin (B) and N-cadherin(C); *P<0.01 compared with negative control group圖4 Western blot檢測miR-26b對C33A細胞系E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的影響Fig 4 Effect of miR-26b on the expressions of E-cadherin and N-cadherin in the C33A cell line by the Western blot assay n=3)

*P<0.01 compared with negative control group圖5 實時定量PCR分析轉染miR-26b對其預測靶基因表達水平的影響Fig 5 Effect of miR-26b mimic on the expression of predicted target genes via quantitative PCR

*P<0.01 compared with negative control group圖6 miR-26b對雙熒光素酶相對活性的影響Fig 6 Effect of miR-26b on the relative luciferase activity in C33A cell n=3)

EMT指的是上皮細胞在形態(tài)學上向間質(zhì)細胞表型的轉變。同時，伴隨上皮細胞標志物的下降(如E-cadherin)，而間質(zhì)細胞標志物的明顯上升(如vimentin、N-cadherin等)，從而導致細胞間的連接下降，腫瘤細胞的遷移、侵襲及轉移能力明顯增強[7]。最近，有研究顯示miRNA也參與了EMT過程，如miR-132/212可通過調(diào)節(jié)前列腺癌細胞SOX4表達抑制TGF-β誘導EMT的形成[8-9]。miR-132 通過調(diào)節(jié)TGFβ1/Smad2的表達抑制非小細胞肺癌的遷移、侵襲以及EMT的發(fā)生[10]。本研究顯示，過表達miR-26b可明顯促進E-cadherin蛋白表達，而下調(diào)N-cadherin表達水平，從而抑制C33A宮頸癌細胞系EMT的形成。

為了進一步探討miR-26b作用的機制，通過TargetScan、PicTar和miRDB 3個miRNA靶其因預測的軟件及相關研究，推測CXCL14、Smad4、TRAF5和EphA2可能為miR-26b的潛在靶基因。雙熒光素酶實驗證實， miR-26b僅作用于Smad4基因3′UTR端，調(diào)節(jié)靶蛋白Smad4表達。已有研究顯示，在EMT發(fā)生過程中，主要的信號途徑為TGF-β2/Smad、Wnt/β-catenin、Notch等信號通路，其中TGF-β2/Smad是最主要促進ETM發(fā)生的主要途徑，可分為Smad依賴通路和非Smad依賴通路[8,10]。本研究顯示，miR-26b主要依賴Smad通路來調(diào)節(jié)宮頸癌細胞EMT的發(fā)生，轉染miR-26b后抑制Smad4蛋白表達，影響Smad三聚體的形成，從而促進EMT形成。在晶狀體EMT發(fā)生過程中，miR-26b通過調(diào)節(jié)Smad4和COX-2表達，從而促進上皮細胞EMT的發(fā)生[11]?？傊?，本研究提示，miR-26b可能通過調(diào)節(jié)Smad4基因的表達，影響宮頸癌細胞的遷移和EMT發(fā)生，這將為宮頸癌的靶向治療提供新的線索。