邱 泓，馬紅亮，馬 芬，毛盼盼，高 人，尹云鋒

(濕潤亞熱帶生態(tài)地理過程省部共建教育部重點實驗室/福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，福建福州 350007)

植物單寧(vegetable tannin)，別稱植物多酚(plant polyphenol)，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚化合物[1]。它在維管植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，主要存在于植物的皮、根、葉、果實中，含量可達20%[2-3]。單寧在生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用，紅樹植物的樹皮和果皮中往往具有較高含量的單寧，它們可形成保護層，起到抑制微生物活動、殺滅病原菌的作用[4]。同時單寧還是一種化感物質(zhì)[5]，研究表明，Kalmia屬植物可通過產(chǎn)生單寧而影響腐殖質(zhì)中營養(yǎng)的循環(huán)，進而引起云杉生長的非生物學(xué)阻礙[6]。近年來，單寧在生態(tài)系統(tǒng)土壤氮循環(huán)中發(fā)揮的作用越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[7-9]。

氮循環(huán)是指自然界中的氮素以有機態(tài)、無機態(tài)和分子態(tài)的形式存在且互相轉(zhuǎn)化的過程[10]。其中，土壤有機氮主要以蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、氨基糖以及一些雜環(huán)狀的氮化合物等形式存在[11-12]，且不同生態(tài)系統(tǒng)中的有機氮(包括氨基酸和蛋白質(zhì))含量不同[13-14]。作為一種碳源，單寧可通過其自身性質(zhì)參與氮素循環(huán)，它在土壤中能與蛋白質(zhì)、生物堿、多糖等發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生不溶性復(fù)合物[15]。單寧影響土壤氮保持、降低土壤氮礦化量的研究已有許多報道，通過研究單寧對土壤淋溶層碳氮動態(tài)的影響發(fā)現(xiàn)，單寧抑制總氨化速率的能力遠高于纖維素，且可通過固定土壤中的氮，降低土壤的凈氮礦化量[7]。單寧酸的加入可降低土壤硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量[16]。源于石南科和冷杉的純化單寧主要通過捆綁或固定有機氮以及降低氮礦化量的形式來降低無機氮有效性[17]。縮合單寧可降低碳氮礦化量及酶活性，且可提高真菌和細菌的比值，因此，研究認為，葉片組織中的縮合單寧濃度是影響微生物群落和活性的一個因素[8]。此外，單寧還與土壤微生物含量有關(guān)，在紅松林土壤中的單寧含量與土壤中的氨化細菌和硝化細菌含量呈正相關(guān)關(guān)系[18]。由于單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物的產(chǎn)生與pH值條件有關(guān)[19]，因此，土壤理化性質(zhì)可調(diào)節(jié)單寧對氮素的影響。由于來自不同植物的單寧含量、結(jié)構(gòu)各異[7，20]，單寧對氮素轉(zhuǎn)化的影響也會因有機氮的類型及單寧含量的不同而有所差異，因此，探討不同單寧含量與土壤有機氮的關(guān)系已成為研究單寧對氮素轉(zhuǎn)化與保持的重要環(huán)節(jié)之一，而目前的研究主要將單寧和有機氮反應(yīng)形成單寧-有機氮復(fù)合物作為解釋單寧影響氮素的原因，但關(guān)于單寧和有機氮反應(yīng)形成單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物的條件目前還不清楚，這制約了人們對其產(chǎn)物特性、動態(tài)變化和氮循環(huán)的認識。

本試驗通過室內(nèi)研究不同濃度的單寧酸與不同濃度的各種有機氮在2種pH值條件下的反應(yīng)，探究單寧與有機氮的關(guān)系，對明確單寧在生態(tài)系統(tǒng)土壤氮素循環(huán)中發(fā)揮的作用具有重要的理論參考價值。

1 材料與方法

1.1 預(yù)試驗

選用單寧酸(tannin acid，簡稱TA)作為單寧代表物。配制不同濃度單寧酸，使其與不同濃度的各種氨基酸反應(yīng)，觀察發(fā)現(xiàn)，單寧酸能與堿性氨基酸中的精氨酸(arginine，簡稱Arg)和賴氨酸(lysine，簡稱Lys)發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，因此選用精氨酸和賴氨酸進行下一步試驗。用不同濃度單寧酸與不同濃度牛血清蛋白(bovine serum albumin，簡稱BSA)、酪蛋白(casein，簡稱Cas)反應(yīng)，觀察發(fā)現(xiàn)，單寧酸與2種蛋白質(zhì)均能發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，因此選用2種蛋白質(zhì)進行下一步試驗。因此，選用單寧(單寧酸)和4種有機氮(精氨酸、賴氨酸、牛血清蛋白、酪蛋白)參與試驗。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)計3種濃度梯度，分別為HO組(高有機氮比例組)：含25 mg單寧酸和200 mg有機氮；M組(適中比例組)：含50 mg單寧酸和100 mg有機氮；HT組(高單寧比例組)：含100 mg單寧酸和50 mg有機氮。使用2種pH值梯度，分別為 0.2 mol/L pH值為4.7的醋酸-醋酸鈉緩沖液和0.2 mol/L pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)溶液。每處理設(shè)3個重復(fù)。

具體試驗操作過程為在試管中加入10 mL緩沖液后，分別加入不同比例組的5 mL單寧酸和5 mL有機氮，HO組、M組、HT組單寧酸濃度分別為5、10、20 g/L，有機氮濃度分別為40、20、10 g/L，置于 200 r/min 搖床振蕩30 min后，然后在 4 000 r/min 離心機上離心10 min，收集清液，待測。

1.3 樣品分析

1.3.1 單寧含量測定 吸取1 mL樣液，加入5 mL 10%三乙醇胺和100 μL 0.05 mol/L氯化鐵，并用蒸餾水將溶液體積補充至20 mL，混勻，15 min后用紫外可見光譜儀(島津UV-2450，下同)測定混合液在510 nm處的吸光度[19]。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定 吸取1 mL樣液，加入5 mL考馬斯亮藍G250，混勻，10 min后用紫外可見光譜儀測定混合液在595 nm處的吸光度[21]。

1.3.3 精氨酸測定 吸取1 mL樣液，加入8 mL 15 g/L氫氧化鈉和1 mL顯色劑(含50 g/L甲萘酚、0.2 mL/L雙乙酰)，混勻，在30 ℃條件下水浴15 min，取出，在室溫條件下放置30 min后，混勻，然后用紫外可見光譜儀測定混合液在 525 nm 處的吸光度[22-23]。

1.3.4 賴氨酸測定 吸取1 mL樣品，加入2 mL茚三酮試劑和0.2 mL 0.2%維生素C溶液，混勻，蓋上玻塞，置于沸水中水浴加熱15 min后取出，并立即置于冰水中冷卻15 min，然后用60%乙醇溶液將溶液體積補充至20 mL，混勻，用紫外可見光譜儀測定混合液在570 nm處的吸光度[24]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Origin 8.0和SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及作圖，圖中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，不同處理與變量之間的顯著性檢驗采用單因子方差分析(ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)。通過測定反應(yīng)后清液中的單寧酸與各有機氮濃度來計算參與反應(yīng)的單寧酸與有機氮的沉降量，探究單寧與有機氮的反應(yīng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酸與蛋白質(zhì)的反應(yīng)

由圖1可知，在pH值為4.7的條件下，M組的單寧酸沉降比例最高，為91.96%，HT組最低，為52.76%；牛血清蛋白沉降比例在M組最高，為93.87%，在HO組最低，為76.50%。單寧酸的沉降量在HT組最大，為52.76 mg，在HO組最小，為20.53 mg；牛血清蛋白的沉降量在HO組最大，為153.00 mg，在HT組最小，為42.01 mg。

在pH值為7.0的條件下，HT組單寧酸的沉降比例(48.71%)顯著低于其他2組；3組牛血清蛋白的沉降比例差異不顯著，均值為25.14%。單寧酸的沉降量在HT組最大，為48.71 mg，在HO組最小，為 23.22 mg；牛血清蛋白的沉降量在HO組最大，為50.77 mg，在HT組最小，為11.62 mg。

由圖2可知，在pH值為4.7的條件下，HO組單寧酸幾乎不參與反應(yīng)，其沉降比例僅為0.63%，HT組單寧酸(63.02%)顯著高于M組單寧酸(60.53%)；HO組酪蛋白的沉降比例最高，為98.59%，HT組最低，為94.74%。單寧酸的沉降量在HT組最大，為63.02 mg，HO組最小，僅為 0.16 mg；相反，酪蛋白的沉降量在HO組最大，為197.19 mg；在HT組最小，為47.37 mg。

在pH值為7.0的條件下，參與反應(yīng)的單寧酸和酪蛋白沉降比例的顯著性差異規(guī)律相同，兩者均在HT組最高(單寧酸為27.58%，酪蛋白為97.07%)，在M組最低(單寧酸為5.23%，酪蛋白為61.01%)。單寧酸的沉降量在HT組最大，為 27.58 mg，在M組最小，僅為2.62 mg；相反，酪蛋白的沉降量在HO組最大，為132.83 mg，在HT組最小，為48.54 mg。

2.2 單寧酸與氨基酸的反應(yīng)

由圖3可知，在pH值為4.7的條件下，單寧酸沉降比例在HO組最高，為81.97%，在HT組最低，為9.73%；各濃度梯度的賴氨酸沉降比例沒有顯著差異，均值為39.09%。單寧酸的沉降量在M組最高，為22.06 mg，在HT組最低，為 9.73 mg；賴氨酸的沉降量在HO組最大，為81.12 mg；在HT組最小，為18.34 mg。

在pH值為7.0的條件下，M組單寧酸沉降比例(38.27%)顯著高于其他2組；HO組(39.72%)賴氨酸沉降比例顯著低于其他2組。而單寧酸的沉降量在HT組最大，為29.91 mg，在HO組最小，為6.89 mg；賴氨酸的沉降量在HO組最大，為79.44 mg，在HT組最小，為22.63 mg。

由圖4可知，在pH值為4.7的條件下，M組的單寧酸沉降比例顯著高于其他2組，為45.41%；精氨酸沉降比例在M組最高，為57.00%，在HT組最低，為49.76%。單寧酸的沉降量在M組最大，為22.71 mg，在HO組最低，僅為3.42 mg；精氨酸的沉降量在HO組最大，為106.20 mg，在HT組最小，為 24.88 mg。

在pH值為7.0的條件下，單寧酸沉降比例沒有顯著差異，總體均值為44.21%；精氨酸沉降比例僅M組(59.78%)與HT組(58.02%)有顯著差異。單寧酸的沉降量在HT組最大，為41.48 mg，在HO組最小，為11.66 mg；精氨酸的沉降量在HO組最大，為117.71 mg，在HT組最小，為29.01 mg。

3 討論

本試驗結(jié)果表明，pH值可影響單寧-有機氮復(fù)合物的沉降量。酪蛋白、牛血清蛋白的等電點pH值分別為4.6、4.7。有研究發(fā)現(xiàn)，單寧和牛血清蛋白產(chǎn)生最高沉淀量的pH值接近于牛血清蛋白的等電點(pH值=4.7)[25]，其原因為蛋白質(zhì)處于等電點時，蛋白質(zhì)分子之間的靜電排斥最小[26]，此時蛋白質(zhì)容易發(fā)生凝集產(chǎn)生沉淀，因此在pH值為4.7的條件下，2種蛋白質(zhì)沉淀的比例和質(zhì)量整體較高；但在pH值=7.0時，遠離等電點，依然有蛋白質(zhì)沉淀(雖然沉淀比例整體較等電點低)，說明單寧具有結(jié)合蛋白質(zhì)的能力。HO組、M組、HT組單寧酸-牛血清蛋白復(fù)合物在pH值=4.7時的沉降量分別比 pH值=7.0時高134.53%、91.84%、57.09%；HO組、M組、HT組單寧-酪蛋白復(fù)合物在pH值=4.7時的沉降量分別比 pH=7.0時高44.38%、101.16%、45.02%；HO組、HT組的單寧酸-酪蛋白復(fù)合物的沉降量高于單寧酸-牛血清蛋白復(fù)合物的沉降量。Hagerman等研究發(fā)現(xiàn)，單寧在pH值大于9.0時會失去與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力，這與單寧酚基的酸離解常數(shù)(pKa)有關(guān)[27]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使在較低單寧含量(25 mg)的條件下，只要有較高含量的蛋白質(zhì)就會發(fā)生沉降，且與蛋白質(zhì)的類型有關(guān)。研究表明，白堅木單寧、單寧酸與牛血清蛋白的反應(yīng)比例分別為 1 ∶4、2 ∶3[28]，而不同植物提純單寧與牛血清蛋白的反應(yīng)比例在2 ∶5～3 ∶5之間[15]。本研究中單寧酸與牛血清蛋白的反應(yīng)比例則為1 ∶7(HO組，pH值=4.7)～4 ∶1(HT組，pH值=7.0)；在相同pH值條件下，pH值=4.7時，該比例為1 ∶7(HO組)～6 ∶5(HT組)；pH值=7.0時，該比例為 1 ∶2(HO組)～4 ∶1(HT組)，說明單寧與有機氮反應(yīng)的濃度比例會在很大程度上影響參與反應(yīng)的單寧和有機氮的量與比例。

HO組、M組單寧酸-賴氨酸復(fù)合物在pH值=4.7 時的沉降量分別比pH值=7.0高17.70%、0.49%；HO組、M組、HT組單寧酸-精氨酸復(fù)合物在 pH值=4.7時的沉降量分別比pH=7.0低15.27%、2.85%、47.01%，相同條件下單寧酸-精氨酸復(fù)合物的沉降量高于單寧酸-賴氨酸復(fù)合物的沉降量。本試驗中賴氨酸、精氨酸的等電點分別是9.7、10.7，由于2種氨基酸的等電點與pH值=7.0條件更為接近，因此pH值=7.0時的氨基酸沉降量整體較pH值=4.7 條件大。在單寧與氨基酸的反應(yīng)中，氨基酸提供質(zhì)子化的氨基(NH3+)(在pH值高于7.0的條件下，沒有質(zhì)子化作用)，單寧提供負電荷(在pH值小于4.0的條件下，單寧幾乎不具有電荷數(shù))[29]，使得二者結(jié)合。精氨酸本身能夠形成多重氫鍵[30]，有研究發(fā)現(xiàn)，氫鍵在單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成中具有重要作用[31]，這可能是在單寧酸與氨基酸的反應(yīng)中，單寧酸-精氨酸復(fù)合物沉降量多于單寧酸-賴氨酸復(fù)合物沉降量的原因。在單寧酸與有機氮的反應(yīng)中，單寧酸-氨基酸復(fù)合物的沉降量低于單寧酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物的沉降量，且并不是所有的氨基酸都和單寧發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，前期試驗結(jié)果表明，丙氨酸、谷氨酸、甲硫氨基酸、無機氮不能與單寧酸反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，這與單寧性質(zhì)有關(guān)，本研究選用單寧酸作為單寧代表物，而在挪威云杉提純縮合單寧與20種氨基酸反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，單寧僅與精氨酸發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)pH值在4.0～7.0范圍內(nèi)[19]；從歐洲蕨(Pterdiumaquilinum)提取的單寧能與組氨酸反應(yīng)產(chǎn)生沉淀[32]；也有研究發(fā)現(xiàn)，縮合單寧(原花青素)能與丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸發(fā)生反應(yīng)[25]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單寧酸能與精氨酸、賴氨酸反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，進一步說明單寧結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性對有機氮沉降的影響不同。

一般來講，長江以南的土壤多呈酸性或強酸性，長江以北的土壤多呈中性或堿性[33]。細分到不同土壤，酸性或強酸性土壤有鐵鋁土、淋溶土、半淋溶土等；中性或堿性土壤有鈣層土、干旱土、漠土、初育土、半水成土、水成土、鹽堿土、高山土等[34]。典型的農(nóng)業(yè)土壤通常具有較高的pH值，有時甚至超過8.0[35]，我國亞熱帶的土壤主要呈酸性，pH值在4.0左右[36]；此外，各種土壤的單寧數(shù)量和結(jié)構(gòu)不同[31]。因此，單寧與有機氮形成的復(fù)合物在土壤中的作用與土壤類型有關(guān)。目前研究表明，穩(wěn)定的單寧和有機氮的復(fù)合物是土壤保留有機氮的重要機制[19，37]，單寧通過固定有機氮[7，17]降低土壤中的無機氮[16，38]，直接或間接影響土壤中微生物[37，39]的方式影響氮素轉(zhuǎn)化。Northup等研究認為，單寧-蛋白復(fù)合物具有降低氮淋溶的作用，并可作為1個氮源被一些植物的菌根共生體重新利用[40]。雖然單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物很難被酶降解[41]，但其釋放氮素的現(xiàn)象已有報道[6，28]，而單寧-有機氮復(fù)合物與單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物的降解性有何異同還未見報道。Adamczyk等研究發(fā)現(xiàn)，單寧不僅能與一些氨基酸和蛋白質(zhì)反應(yīng)，還能與一些肽類、多胺、氨基糖類發(fā)生反應(yīng)[19]，因此，在土壤中單寧與有機氮的結(jié)合很可能是其影響氮轉(zhuǎn)化的重要原因。此外，單寧能與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)生復(fù)合物[42]。張瑞娜等研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸能與Fe3+離子反應(yīng)生成單寧酸鐵，而單寧酸鐵具有吸附無機氮的作用[43]，在土壤中也很有可能有相似反應(yīng)。因此，單寧在土壤中對氮素轉(zhuǎn)化的影響既要考慮凋落物性質(zhì)、數(shù)量的差異，也要考慮土壤類型和理化性質(zhì)的調(diào)節(jié)。

4 結(jié)論

單寧、有機氮和反應(yīng)溶液的pH值可影響單寧-有機氮復(fù)合物的沉降量。較低的pH值有利于沉降蛋白質(zhì)，較高的pH值有利于沉降氨基酸，且在相同條件下單寧酸沉降蛋白質(zhì)的量大于氨基酸。因此，在亞熱帶酸性土壤的氮素轉(zhuǎn)化過程中蛋白質(zhì)動態(tài)變化受單寧的影響可能較氨基酸大。