郭坤元，林先明，何美軍，郭漢玖

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北恩施 445000)

野葛[Puerarialobata(Willd.) Ohwi]別稱甘葛或者葛藤，是我國傳統(tǒng)的大宗中藥材，富含淀粉[1]及異黃酮類物質(zhì)[2]，其中淀粉具有可食用性，異黃酮類物質(zhì)具有降血壓血脂[3]、抗氧化[4]、保護肝[5]等作用，具有良好的食用和藥用價值。我國野生和人工栽培的葛類資源年總量比較豐富[6]，但是目前相關(guān)研究大多停留在育種和栽培等比較基礎(chǔ)的層面上，有關(guān)野葛功能基因及調(diào)控機制的研究還比較少，因此，開展野葛功能基因及調(diào)控機制的研究迫在眉睫。

核酸酶是一種特異性作用于磷酸二酯鍵的酶，能夠水解核酸鏈生成低聚核苷酸或者單核苷酸[7]，在遺傳物質(zhì)的重組[8]、堿基錯配識別和切割異源DNA[9]等多個途徑中起著重要的作用，同時核酸酶活性還依賴于如鈣離子等各種各樣的金屬離子[10-12]。一些植物中的鈣離子依賴性核酸酶已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并報道，比如利用基因芯片技術(shù)在水稻中發(fā)現(xiàn)了1種OsNAC4編碼的參與核DNA降解的鈣離子依賴性核酸酶[13-14]；在小麥中發(fā)現(xiàn)了1種可以凋亡細胞并降解和碎裂細胞核DNA的鈣離子依賴性核酸酶[15]；在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了1種分子量為26 ku，對DNA和RNA均有降解能力的鈣離子依賴性核酸酶[16]，但是到目前為止，在中藥材中有關(guān)核酸酶基因及其功能機制方面的研究還未見報道。本研究以野葛為試驗材料，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、 cDNA末端快速擴增技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends，簡稱RACE)等方法克隆野葛鈣離子依賴性核酸酶基因PlCaN的cDNA全長序列，并對其進行生物信息學(xué)分析和蛋白表達載體的構(gòu)建，希望可以通過這些結(jié)果為后續(xù)該基因功能等方面的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野葛試驗材料采自華中藥用植物園試驗基地，帶回實驗室后用液氮速凍并立即置于-80 ℃儲藏備用。大腸桿菌菌株DH5α保存于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所。

試劑主要包括RACE cDNA擴增試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]、總RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit[天根生化科技(北京)有限公司]、FastQuant RT Kit[天根生化科技(北京)有限公司]、pMD18-T載體試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]、DNA marker[天根生化科技(北京)有限公司]、PCR產(chǎn)物回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，其他生化試劑均為進口或者國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 野葛總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 取采集的儲藏于 -80 ℃ 的野葛材料，在液氮下研磨均勻后按照總RNA提取試劑盒說明書進行RNA提取。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和熒光分光光度計檢測提取的RNA濃度和質(zhì)量。以提取的RNA為模板，按照FastQuant RT Kit說明書進行反轉(zhuǎn)錄試驗。

1.2.2 引物設(shè)計 通過對GenBank上已經(jīng)登錄的擬南芥(Arabidopsisthaliana，登錄號AY128927)、煙草(Nicotianasylvestris，登錄號XM_009798421)、玉米(Zeamays，登錄號NP_001147648)、谷子(Setariaitalic，登錄號XM_004968244)、高粱(Sorghumbicolor，登錄號XM_002457238)、大豆(Glycinemax，登錄號NM_001255851)等植物的核酸酶氨基酸序列進行同源性比對，挑選出高度保守區(qū)段序列，設(shè)計引物P1和P2(表1)。

1.2.3PlCaN保守序列克隆 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，擴增PlCaN保守區(qū)域片段。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括2.0 μL模板cDNA、5 μL 10×PCR緩沖液、2.5 μL dNTP(10 mmol/L)、各1.0 μL上下游引物(20 μmol/L)、0.5 μL DNA聚合酶(5 U/mL)，用無菌去離子水補足至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。目的片段回收和純化按照DNA膠回收試劑盒說明書進行。將純化回收的DNA連接至克隆載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，隨機挑取單克隆進行PCR驗證，陽性克隆接種于含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，由華大基因測序。

表1 引物名稱和序列

1.2.4PlCaN的RACE擴增及全長cDNA序列的獲得 按照TaKaRa 5′-Full RACE Kit和3′-Full RACE Kit說明書將野葛總RNA分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA；按照TaKaRa 5′RACE和3′RACE試劑盒說明書以及已得到的核心片段序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計5′-RACE和3′-RACE反應(yīng)所需的引物P3、P4、P5(表1)，分別對PlCaN的5′端和3′端進行PCR擴增，5′-RACE以5′-RACE-first-strand cDNA和Outer PCR產(chǎn)物為模板，3′-RACE以3′-RACE-first-strand cDNA為模板。PCR產(chǎn)物的回收、克隆與測序方法均同“1.2.3”節(jié)。將PlCaN的核心片段、5′端和3′端序列利用軟件進行拼接，獲得該基因的全長cDNA序列。根據(jù)拼接得到的全長序列，分別在5′端和3′端設(shè)計特異性引物P6、P7(表1)，進行PCR擴增得到目的基因，PCR產(chǎn)物的回收、克隆與測序方法均同“1.2.3”節(jié)。

1.2.5PlCaN序列的生物信息學(xué)分析 將獲得的PlCaN編碼的氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對分析，利用DNAMAN軟件對已發(fā)表的其他植物的CaN編碼的氨基酸序列進行同源性分析，并通過MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。通過在線網(wǎng)站分析，預(yù)測相對分子質(zhì)量及等電點(http：//web.expasy.org/protparam/)，進行疏水性(http：//web.expasy.org/protscale/)，利用TMHMM預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、信號肽(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)、亞細胞定位(http：//psort.hgc.jp/form.html)、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(ExPASy在線)，利用SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/)進行結(jié)構(gòu)域的三維同源建模。

1.2.6 pBRT7-PlCaN表達載體的構(gòu)建 根據(jù)目的基因PlCaN的核苷酸序列設(shè)計引物P8和P9(表1)擴增PlCaN的cDNA全長。回收PCR產(chǎn)物并將回收產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，然后測序。對測序正確的pMD18-T-PlCaN質(zhì)粒和原核表達載體pBRT7分別進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用T4連接酶于16 ℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性單菌落進行PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 野葛總RNA的提取與檢測

如圖1所示，2次提取的RNA電泳條帶清晰，說明葉片總RNA提取結(jié)果較好，同時D260 nm/D280 nm平均值為1.98，說明提取的總RNA純度比較高，適用于后期cDNA的制備和PCR擴增。

2.2 PlCaN全長cDNA的克隆

以野葛cDNA為模板，用引物P1、P2擴增得到1條約 850 bp 的PCR產(chǎn)物(圖2泳道1)，擴增產(chǎn)物長度符合引物設(shè)計。通過在美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，簡稱NCBI)數(shù)據(jù)庫中的比對分析，發(fā)現(xiàn)該序列與其他植物的CaN核酸序列相似度較高，因此推測該序列為PlCaN基因的保守區(qū)片段。根據(jù)設(shè)計的RACE引物P3、P4、P5進行PCR擴增，獲得CaN的5′端980 bp(圖2泳道2)和3′端630 bp(圖2泳道3)，經(jīng)純化回收后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α，選取陽性克隆進行測序。用DNAMAN對5′-RACE和3′-RACE所得序列和保守區(qū)序列進行拼接得到cDNA全長電子拼接序列，以其為模板設(shè)計引物擴增CaN基因全長cDNA序列，結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物的長度為1 000 bp左右(圖2泳道4)，并進一步對其進行載體連接測序驗證，得到長度為 1 008 bp 的片段，將該片段再次在NCBI的數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析，進一步驗證所得基因序列為PlCaN的cDNA序列。

2.3 PlCaN生物信息學(xué)分析

利用在線網(wǎng)站(http：//web.expasy.org/ protparam/)預(yù)測PlCaN蛋白相對分子質(zhì)量為37.3 ku，等電點為9.4，化學(xué)式為C1 669H2 629N477O479S8，共5 262個原子數(shù)。蛋白親/疏水性預(yù)測結(jié)果顯示，在第105個氨基酸位置疏水性最大，峰值為 1.895，在第322個氨基酸位置親水性最小，谷值為-3.225，整個分布區(qū)域親水性氨基酸區(qū)域多于疏水性氨基酸區(qū)域，可認為PlCaN為親水性蛋白(圖3-A)。TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，PlCaN蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。亞細胞定位分析表明，PlCaN蛋白定位于細胞質(zhì)的概率約為0.450，定位于微體的概率約為0.363，定位于其他細胞器的概率較低。SignalP 4.1 Server分析結(jié)果顯示，C值為0.270，Y值為0.202，S值為 0.265，得分均較低，表明PlCaN蛋白無信號肽(圖3-B)。

利用PredictProtein等在線分析軟件對PlCaN的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白的二級結(jié)構(gòu)由約49%的α-螺旋、19%的β-折疊和32%的不規(guī)則卷曲組成，其中α-螺旋和不規(guī)則卷曲占的比例較高。在NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中對PlCaN的氨基酸序列進行同源性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與高粱(序列登錄號為XP_002457283.1)的同源性最高，為88.0%。在PlCaN整個氨基酸序列中，丙氨酸(Ala)的含量最高，超過了11%，半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)的含量最低，不到 1.5%(圖4-A)，另外蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示它是由3個α-螺旋組成中心結(jié)構(gòu)，另外含有1個β片層和部分不規(guī)則卷曲(圖4-B)，這也與二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果相吻合。

由圖5可知，氨基酸同源性比對顯示，PlCaN與擬南芥、玉米、谷子、高粱、大豆、煙草等植物的序列相似性較高，平均相似率達到86.5%。

利用MEGA軟件對PlCaN進行系統(tǒng)進化分析，選取12種與其同源性較高的植物構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，由圖6可知，PlCaN與高粱、水稻(Oryzasativa)的親緣關(guān)系最近，與蕪菁(Brassicarapa)、煙草、樟子松(Pinussylvestris)等物種的親緣關(guān)系較遠。

2.4 pBRT7-PlCaN表達載體鑒定

對構(gòu)建好的pBRT7-PlCaN表達載體進行PCR鑒定，由圖7可知，PlCaN的長度為1 000 bp，可見擴增片段大小正確，表明蛋白表達載體pBRT7-PlCaN構(gòu)建成功，可以進行后續(xù)的融合蛋白誘導(dǎo)等試驗。

3 討論與結(jié)論

野葛是豆科的一種藤本植物，既具有藥用價值又具有食用價值，淀粉和葛根黃酮是其主要的功能藥效成分。本研究利用RT-PCR技術(shù)從葛根中克隆了1種鈣離子依賴性的核酸酶，其全長為1 008 bp，編碼335個氨基酸，序列比對結(jié)果表明PlCaN與谷子、高粱等有很高的同源性，為Ca2+依賴型，參與降解核酸底物等生理功能[10]；預(yù)測PlCaN蛋白相對分子質(zhì)量為37.3 ku，等電點為9.4，是沒有跨膜結(jié)構(gòu)域、不含信號肽分子的親水性蛋白，亞細胞定位，它最有可能定位于細胞質(zhì)；蛋白質(zhì)二維和三維結(jié)構(gòu)顯示其α-螺旋和不規(guī)則卷曲所占比例較高；進化樹分析表明PlCaN與高粱、水稻的親緣關(guān)系最近，與蕪菁、煙草、樟子松等物種的親緣關(guān)系較遠。本研究還構(gòu)建了pBRT7-PlCaN重組質(zhì)粒，并進一步鑒定該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功?？傊?，本研究為下一步利用實時定量PCR技術(shù)分析野葛PlCaN基因時空表達特性以及PlCaN蛋白誘導(dǎo)表達、純化和酶活特性研究奠定了基礎(chǔ)。另外，將克隆得到的基因轉(zhuǎn)化到模式植物擬南芥中進一步研究其功能特征也將是今后的研究方向。