盧杰，高莉莉，鄧珊珊，程丹丹，姜世君

（大慶醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，黑龍江 大慶 163312）

腫瘤是一種多基因疾病，目前已發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的基因在500種以上，腫瘤分子病因的復(fù)雜性和多樣性決定了腫瘤研究工作的艱巨性，淋巴細(xì)胞發(fā)生了惡變即稱為淋巴瘤，按照“世界衛(wèi)生組織淋巴系統(tǒng)腫瘤病理分類標(biāo)準(zhǔn)”大體可分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤兩大類。在我國，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤中最常見的類型，幾乎占所有病例的1/3，主要是“侵襲性”或“中高度惡性”淋巴瘤。DLBCL的診斷可以依據(jù)典型的臨床表現(xiàn)，如淋巴結(jié)腫大。目前，唯一可靠的診斷DLBCL的標(biāo)準(zhǔn)是組織病理學(xué)檢查結(jié)果[1]。因而發(fā)掘彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤腫瘤標(biāo)志物是非常有必要，本項(xiàng)目檢測彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者和正常體檢者miR-155、HGAL和RhoA的相對表達(dá)水平，探討miR-155與HGAL及RhoA的關(guān)系，及以上診斷標(biāo)志物與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）發(fā)生進(jìn)展的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 TRIZOL、Lipo2000購自美國Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、DL2000、SYBR Real Time試劑盒，購自 TaKaRa公司；RNase Inhibitor、DNase I、Loading Buffer購自美國Fermentas公司；Real Time PCR 8聯(lián)管購自美國BIO-RAD公司；血清總蛋白提取試劑盒，普利萊基因技術(shù)有限公司；2720型PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品，Chromo4熒光定量PCR儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。Anti-GCET2/HGAL antibody(ab89180)，Anti-RhoA antibody(ab54835)，Anti-GAPDH antibody(ab37168)購自ABCAM公司。miR-155 mimics由上海生工生物工程有限公司合成；Dual-Luciferase? Reporter Assay System，E1910為Promega公司產(chǎn)品；熒光酶標(biāo)儀微孔板檢測系統(tǒng)是Spectra Max M5e。

1.2 方法 ①樣品的采集：采集大慶市龍南醫(yī)院新入院且未放化療或手術(shù)的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者靜脈血20份，以EDTA-K2抗凝管采集抗凝血，取職工體檢時(shí)抽取的靜脈血作對照，經(jīng)病理類型組織細(xì)胞學(xué)、影像學(xué)、臨床表現(xiàn)等確診。②引物設(shè)計(jì)：Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成特異性引物。引物設(shè)計(jì)情況：HGAL：正向引物：GAGAAAACAGGCGGCAGC-3’；反向引物：GCAGAAACACCCTTCAGCG-3’，產(chǎn)物長度116 bp。RhoA：正向引物：ATTGTTGGTGATGGAGCCTGT-3’；反向引物：CCCACAAAGCCAACTCTACCT-3’，產(chǎn)物長度148 bp。GAPDH：正向引物：ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’；反向引物：GTTGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’，產(chǎn)物長度123 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。miR-155：RT引物：CGCTGCTACCTGAGAGTAGACCAGATGCAGCGACCCCT；正向引物：TTAATGCTAATCGTGATAG；反向引物：ACCTGAGAGTAGACCAGA；產(chǎn)物長度 48bp。U6：RT引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT；正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA；反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT；產(chǎn)物長度94 bp。③總RNA的提取：用TRIZOL通用型RNA快速提取試劑盒，提取樣品RNA，最后加入30μl無RNase的水，溶解RNA。④RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA：RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的操作程序如下：4μlRNA模板、2μl RT-buffer、1μl dNTP、1μl OligodT引物、10μl DEPC水，混勻，70 ℃ 5 min，立即冰浴，加入1 μl RNase Inhibitor、1 μl M-MLV，反應(yīng)條件：30 ℃ 10 min；42 ℃ 60 min；70℃ 10 min。⑤Real Time PCR檢測：取0.2 ml薄壁PCR管，分別編號，體系如下：SYBR Premix Ex TaqTM（2×），10 μl；PCR 正向引物（10 μM），1 μl；PCR 反向引物（10μM），1μl；Rox（50×），0.4μl；cDNA模板，1μl；ddH2O，6.6 μl；20.0 μl反應(yīng)體系。混勻，置于熒光定量PCR儀中。變性，95℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)：95℃ 5 s，60℃ 15 s；溶解曲線：95℃ 15 min；60℃ 1 min；95℃ 15 min；用不含cDNA模板的ddH2O作為陰性對照，用GAPDH作為內(nèi)參?？梢酝ㄟ^溶解曲線驗(yàn)證引物的特異性和結(jié)果的可信度。采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。⑥western-blotting試驗(yàn)：首先提取血清中的總蛋白，每100μl血清樣本加入200μl含蛋白酶抑制劑的蛋白提取解液，之后放冰上30min；14000 rpm離心20 min；取上清，加入4x蛋白Loading buffer，進(jìn)行SDSPAGE電泳和western-blotting檢測。采用ECL發(fā)光檢測：將ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒中的試劑A和B進(jìn)行等體積混勻，然后滴到PVDF膜上，2 min后，將PVDF膜放到保鮮膜上，用濾紙將殘余液體吸干，保鮮膜覆蓋完全，在暗盒內(nèi)將膜與X膠片曝光約5 min，然后用顯影液顯影后再用定影液進(jìn)行定影。用圖像分析系統(tǒng)對Western blot目的條帶進(jìn)行灰度測定，再用Quantity One軟件對該結(jié)果進(jìn)行灰度分析。⑦雙熒光素酶檢測結(jié)果a：pSicheck-2-3UTR載體的構(gòu)建：HGAL3′-UTR（長度2 613 bp）擴(kuò)增引物：上游引物：CCGCTCGAGTGAAGTGGCTGGACTAGCATTTG-3’下游引物：ATAAGAATGCCCGGGCTTTGGGACATTAAAATTTATTTACTGG-3’；PCR產(chǎn)物和pSicheck-2載體分別用XhoI和NotI進(jìn)行雙酶切，然后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到top10大腸桿菌中，次日挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定和測序驗(yàn)證。陽性克隆命名為pSicheck-HGAL-UTR。b：HELA細(xì)胞培養(yǎng)和共轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前24 h接種HELA細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；次日早晨細(xì)胞長至85%密度的時(shí)候按照以下準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染材料，見表1。

表1 轉(zhuǎn)染體系（μl）Table 1 Transfection system(μl)

pSicheck-HGAL-UTR、miR-155mimic和miR-155NC均為100 ng/μl。表達(dá)質(zhì)粒和報(bào)告質(zhì)粒以脂質(zhì)體法（Lipofectamine 2 000）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HELA細(xì)胞，按照上表的量轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h后提取HELA細(xì)胞總蛋白。參考E1910試劑盒進(jìn)行海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的活性檢測；用Graph-Pad Prism 4.0軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 MicroRNA熒光定量PCR結(jié)果 檢測DLBCL患者和健康人血清中的miR-155，見圖1。由圖可以看出，DLBCL患者血清中的miR-155高于健康人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 熒光定量PCR結(jié)果 對HGAL和RhoA進(jìn)行熒光定量PCR，見圖2。由圖可以看出，DLBCL患者血中HGAL和RhoA mRNA表達(dá)都低于正常人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 miRNA熒光定量PCR結(jié)果Figure 1 Quantification results of miRNAdetected by Quantitative Real-time PCR

圖2 HGAL和RhoA熒光定量PCR結(jié)果Figure 2 Quantification results of HGAL and RhoAdetected by by Quantitative Real-time PCR

2.3 western-blotting結(jié)果 對HGAL和RhoA進(jìn)行熒光定量PCR，見圖3。由圖可以看出，DLBCL患者血清中HGAL和RhoA蛋白表達(dá)都低于正常人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 HGAL和RhoA western-blotting結(jié)果Figure 3 HGALand RhoAexpression by western-blotting注：A：western-blotting結(jié)果；B：數(shù)值化處理結(jié)果

2.4 雙熒光素酶檢測結(jié)果 pSicheck-HGAL-UTR克隆分別用XhoI和NotI進(jìn)行的雙酶切，見圖4?？梢钥闯龅玫? 600 bp左右的HGAL 3′-UTR的PCR產(chǎn)物大小和pSicheck-2載體大小約6 200 bp的兩個(gè)特異性條帶。說明成功將HGAL 3′-UTR克隆到了pSicheck-2載體中，因此可以進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

為了研究miR-155與HGAL表達(dá)的相關(guān)性，我們構(gòu)建了HGAL的3′-UTR的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。同時(shí)分三組進(jìn)行試驗(yàn)：第一組：UTR+NC組，即轉(zhuǎn)染一個(gè)pSicheck-2-HGALUTR載體和mimic NC組；第二組：UTR+miR-155組，即轉(zhuǎn)染一個(gè)pSicheck-2-HGAL-UTR載體和能與之3′-UTR結(jié)合的miR-155 mimics；第三組：miR-155+vec組，即只轉(zhuǎn)染miR-155 mimics和pSicheck-2載體。之后對雙熒光素酶進(jìn)行鑒定，見圖5。由圖可以看出，第一組的比值高于第二組和第三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），原因是HGAL的3′-UTR能夠增強(qiáng)hRluc的表達(dá)；第二組的值低于第一組的原因是，miR-155和HGAL的3′-UTR結(jié)合后，降低了hRluc的表達(dá)。第二組的值高于第三組的原因是，hRluc沒有3′-UTR的作用，因此表達(dá)很低，同時(shí)，miR-155也沒有發(fā)揮作用。

圖4 pSicheck-2-HGAL-UTR雙酶切鑒定結(jié)果Figure 4 pSicheck-2-HGAL-UTR digested and characterized注：1：DL15 000 DNA Marker：250,1 000,2 500,5 000,75 000,1 000,15 000 bp；2：pSicheck-2-HGAL-UTR用XhoI和NotI進(jìn)行的雙酶切鑒定結(jié)果

圖5 雙熒光素酶檢測結(jié)果Figure 5 Resuts of dual luciferase

3 討論

微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）是長度約22 nt的內(nèi)源性單鏈小RNA，來源于染色體上的非編碼區(qū)，具有高度的保守性[2]。可與編碼蛋白質(zhì)的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，沉默，降解或抑制其表達(dá)，參與調(diào)控基因遺傳、生長發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、新陳代謝、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤形成及疾病發(fā)生發(fā)展等多種生物學(xué)過程[3]，目前已經(jīng)證實(shí)，miRNAs在血清中表現(xiàn)為顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達(dá)穩(wěn)定性。已發(fā)現(xiàn)miRNAs在幾乎所有人類癌癥中都有表達(dá)失調(diào)，血清和體液中含有足夠穩(wěn)定的miRNA的表達(dá)[4]。miRNAs有望成為功能性預(yù)后血清標(biāo)志物和藥物反應(yīng)的研究對象[5]，是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子[6]。

血清miRNAs可能是一種理想的腫瘤標(biāo)志物。腫瘤miRNA在血液中的存在可能是腫瘤死亡、溶解或者由腫瘤細(xì)胞釋放出miRNA到其周圍環(huán)境的結(jié)果[7]。研究表明，miRNAs在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者的血清中是非常豐富的。目前已清楚，miR-155為具有致癌潛能的miRNAs之一[8]，在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的細(xì)胞增殖、細(xì)胞循環(huán)、細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用[9]。葛等實(shí)驗(yàn)表明，B細(xì)胞型非霍奇金淋巴瘤組血漿中miR-155表達(dá)量明顯高于正常對照組和淋巴結(jié)炎性腫大組[10]。Eis等用定量RT-PCR證明了原發(fā)性縱隔B細(xì)胞淋巴瘤中BIC的表達(dá)與miR-155的水平一致，表明BIC為miR-155的前體[11]。

將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具體應(yīng)用到腫瘤研究中，就產(chǎn)生了腫瘤蛋白質(zhì)組的學(xué)科。它以尋找腫瘤標(biāo)志物為目的，以蛋白質(zhì)組學(xué)方法為手段，結(jié)合腫瘤分子機(jī)制的基礎(chǔ)研究與腫瘤檢測、診斷等臨床研究，最終找到能應(yīng)用于臨床的腫瘤檢測和治療的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。miR-155可以通過BMP/TGF-β和Rho A等多種信號通路促進(jìn)淋巴瘤的發(fā)生[12]，Huang等利用蛋白組學(xué)的方法揭示了，在彌漫大B細(xì)胞性淋巴瘤中miR-155直接與PIK3R1（p85α）3'-非編碼區(qū)互動，miR-155過表達(dá)下調(diào)p85α的轉(zhuǎn)錄和翻譯，大大激活了PI3K-Akt通路，從而解釋了miR-155在DLBCL作用的新的分子靶標(biāo)[13]。應(yīng)用IHC對四種差異表達(dá)蛋白EZR、PLEK、GSTP1、HSPB1蛋白表達(dá)在DLBCL組織樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，初步確定這四種蛋白質(zhì)表達(dá)與DLBCL的化療敏感性相關(guān)[14]。在B細(xì)胞不同分化階段發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化而形成的DLBCL，提示不同的癌基因起源，包括BCL-6、HGAL、CD10、CD5、FOXP1等，并且這些癌基因標(biāo)志物與患者預(yù)后相關(guān)[15]。

miR-155通過結(jié)合HGAL基因的3'非編碼區(qū)來直接下調(diào)其表達(dá)，以減少RhoA的活化作用，增強(qiáng)自發(fā)的或由某些化學(xué)誘導(dǎo)物導(dǎo)致的淋巴瘤細(xì)胞的能動性。Dagan等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了hsa-miR-155的細(xì)胞不僅HGAL蛋白的表達(dá)水平降低，而且HGAL mRNA的水平也下降了，說明miR-155不僅直接與HGAL基因的3'-UTR結(jié)合，降低蛋白的表達(dá)，而且干擾了HGAL mRNA的穩(wěn)定性[16]。

本研究通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DLBCL中的miR-155顯著高于，以及HGAL和RhoA顯著低于正常人；用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)，miR-155能與HGAL的3′-UTR結(jié)合，進(jìn)而降低hRluc的表達(dá)，間接表明，在體內(nèi)，miR-155能與HGAL的3′-UTR結(jié)合降低HGAL的表達(dá)。因此認(rèn)為DLBCL中HGAL的下調(diào)與miR-155的表達(dá)升高有關(guān)，miR-155和HGAL可以作為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的檢測標(biāo)志物。而且這種外周血檢測方法，具有無創(chuàng)傷、易于檢測，可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[17]，因而外周血miRNA和蛋白質(zhì)組合檢測可作為腫瘤早期診斷的標(biāo)志物。