帕提古麗·托乎提，莫合塔爾·阿布力孜，顏成旭，曾澤民*

（1.新疆巴州動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆 庫爾勒 841000；2.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊 830001）

布魯氏菌病是由布魯氏菌桿菌引起的人畜共患的傳染－變態(tài)反應(yīng)性疾病。本病具有宿主廣泛、傳染性極強(qiáng)、死亡率不高以及感染后根治困難等特點(diǎn)，是危害最大的人畜共患病之一[1]。目前在家畜中牛、羊、豬最常發(fā)生布魯氏菌病，亦可感染人，嚴(yán)重威脅著人類和動(dòng)物健康。牛、羊、豬等布魯氏菌病感染病畜的組織、尿、乳、產(chǎn)道分泌物、羊水、胎盤及胎兒等具有傳染性[2]。

為了對(duì)新疆巴州地區(qū)奶牛布魯氏菌病病原進(jìn)行分析研究，在焉耆盆地收集奶牛流產(chǎn)胎兒、屠宰病料、陰道分泌物、鮮乳等病料進(jìn)行布魯氏菌的分離培養(yǎng)，鑒定引起牛布魯氏菌病的菌種及其生物型，確定焉耆盆地引起奶牛感染布魯氏菌的優(yōu)勢(shì)菌種及其生物型。

焉耆盆地的焉耆縣、和靜縣、博湖縣、和碩縣四縣的奶牛血清學(xué)監(jiān)測(cè)調(diào)查出現(xiàn)布魯氏菌病陽性奶牛的養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)奶牛戶共收集奶牛流產(chǎn)胎兒57份。按常規(guī)布魯氏菌分離培養(yǎng)法進(jìn)行布魯氏菌分離培養(yǎng)，并對(duì)分離出的疑似布魯氏菌的菌株按照國際布魯氏菌鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行菌種及其生物型鑒定，研究了該區(qū)域奶牛感染布魯氏菌病的優(yōu)勢(shì)菌種及其生物型。研究結(jié)果顯示，焉耆盆地奶牛布魯氏菌病的優(yōu)勢(shì)菌種為牛種布魯氏菌生物3型。

1 材料與方法

1.1 布魯氏菌分離培養(yǎng)

從病畜體內(nèi)組織病料中分離出的布魯氏菌仍是確定布魯氏菌病最可靠的證據(jù)。布魯氏菌多寄生于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，脾臟出菌率最高，肝臟與腎臟次之[3]。

1.2 布魯氏桿菌細(xì)菌培養(yǎng)材料的制備

配制布魯氏桿菌細(xì)菌培養(yǎng)基：用國標(biāo)培養(yǎng)布魯氏菌病的普通布魯氏菌培養(yǎng)基；

布魯氏菌Tb噬菌體：中國疾病預(yù)防控制中心提供；

布魯氏菌抑菌染料硫堇復(fù)紅：巴州動(dòng)物疾病控制與診斷中心配制；

單相血清A、M、R：中國疾病預(yù)防控制中心提供；

布魯氏菌病診斷抗原：由哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)：201007；

布魯氏菌病診斷陽性血清：由哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)：201003。

1.3 布魯氏菌的培養(yǎng)

從流產(chǎn)胎兒組織中分離布魯氏桿菌，取流產(chǎn)胎兒，先用清水把泥土等污物洗凈，然后在3%來蘇爾中浸泡20～30 min，在無菌條件下解剖，分別取肝、脾、腎、淋巴結(jié)、胃內(nèi)容物、肺、心，在無菌條件下接種在布魯氏菌專用固體培養(yǎng)基上，每份樣品各接種2支培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，分大氣環(huán)境和CO2環(huán)境培養(yǎng)。4～5 d后觀察結(jié)果，如未發(fā)現(xiàn)布魯氏菌生長，可繼續(xù)培養(yǎng)觀察2周。如有可疑細(xì)菌生長，可把菌落轉(zhuǎn)移，48 h純化培養(yǎng)，進(jìn)行生物型鑒定。

1.4 布魯氏菌的鑒定

布魯氏菌的鑒定，首先要確定可疑菌是否是布魯氏菌，如果是布魯氏菌，再進(jìn)一步鑒定種和型。

1.4.1 常規(guī)確定布魯氏菌屬的方法

布魯氏菌的鑒定，先把分離培養(yǎng)后挑取的可疑菌做革蘭氏染色鏡檢，如具備以下條件，則可初步確定為布魯氏菌。

一是從菌落生長時(shí)間和形態(tài)觀察：布魯氏菌在普通培養(yǎng)基上不宜生長，在布魯氏菌專用培養(yǎng)基上接種4～5 d或更長時(shí)間，培養(yǎng)出來的菌落大小不等，菌落呈濕潤、圓形、稍隆起，菌苔半透明。小球桿菌或小短桿菌，多為單個(gè)，很少成雙，鏈狀排列。

二是從血清凝集試驗(yàn)觀察：布魯氏菌培養(yǎng)物與布魯氏菌血清作凝集試驗(yàn)（玻片凝集和試管凝集）呈陽性。

1.4.2 布魯氏菌菌種及其生物型鑒定方法

1.4.2.1 初代分離培養(yǎng)時(shí)二氧化碳的需求 被檢流產(chǎn)胎兒組織病料接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每份樣品培養(yǎng)2個(gè)試管，1份放在干燥缸內(nèi)，里面點(diǎn)燃蠟燭密封，蠟燭滅火可產(chǎn)生5%～10%的二氧化碳，另一份接種樣品培養(yǎng)試管放在普通環(huán)境中，37℃培養(yǎng)，分離到布魯氏菌菌株。

1.4.2.2 硫化氫產(chǎn)生量的測(cè)定 將待檢菌的48 h培養(yǎng)物接種在瓊脂斜面上，將醋酸鉛濾紙條夾于斜面與管壁之間，使濾紙條和斜面保持平行，以不接觸斜面為易。濾紙條留在管外1～2㎝，置37℃溫箱培養(yǎng)，經(jīng)2、4、6 d各觀察一次，以毫米計(jì)算濾紙條變黑長度，產(chǎn)生中等量的硫化氫，濾紙條變黑部分長度5～8㎜。

1.4.2.3 染料抑菌試驗(yàn) 將待檢菌48 h培養(yǎng)物接種在pH值6.8的瓊脂平皿上，用蠟筆將平皿分隔呈4～6格，每格接種一株菌，把不同濃度的硫堇、堿性復(fù)紅放在每格培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)，2、4、6 d各觀察一次。如布魯氏菌被抑制則有菌落或菌苔生長。

1.4.2.4 單相特異性血清A、M凝集試驗(yàn) 玻片凝集試驗(yàn)：在清潔無油脂玻片上各滴一滴A、M、R血清，在另一端再滴一滴生理鹽水，然后用接種環(huán)取少許布魯氏菌培養(yǎng)物，在生理鹽水中研磨制成菌懸液，取菌懸液分別加入A、M、R血清中混勻，在1～2 min出現(xiàn)凝集顆粒為陽性，否則為陰性。試管凝集試驗(yàn)：將待檢菌制成抗原，然后按試管凝集反應(yīng)操作程序分別與A、M、R血清做試管凝集反應(yīng)，觀察A、M、R血清凝集程度的差別。

1.4.2.5 噬菌體裂解試驗(yàn) 采用傾注法，將增殖菌比濁成每毫升10億菌體，取0.2 mL加到溶化的并50℃～56℃水浴保溫的半固體培養(yǎng)基中，然后傾注到底層為布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基上。待凝固后，將各種稀釋度的細(xì)菌體滴至不同位置上，干后放37℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h觀察，在觀察中如果在噬菌體處出現(xiàn)透明的噬菌斑即為裂解，否則為不裂解。

1.4.2.6 尿素酶活性試驗(yàn) 待檢布魯氏菌48 h培養(yǎng)物，用滅菌生理鹽水制成每毫升10億菌體的菌懸液，取1 mL輕輕加到尿素酶培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，15 min、30 min，1 h、2 h、6 h和14 h各觀察一次。如培養(yǎng)基由黃變成紅色或紫紅色表示尿素被分解，判定為陽性。

2 結(jié) 果

焉耆盆地收集的57份奶牛流產(chǎn)胎兒按常規(guī)布魯氏菌分離培養(yǎng)法進(jìn)行布魯氏菌分離培養(yǎng)，經(jīng)鑒定分別在焉耆縣收集的奶牛流產(chǎn)胎兒脾臟組織病料培養(yǎng)出來24號(hào)1株菌、和靜縣收集的牛流產(chǎn)胎兒肺臟組織病料中分離到14號(hào)1株菌、博湖縣收集的奶牛流產(chǎn)胎兒脾臟組織病料中分離到59號(hào)1株菌共3株菌株，鑒定出為牛種布魯氏菌生物3型。焉耆縣收集的奶牛流產(chǎn)胎兒肝臟組織病料中分離到的32號(hào)1株菌為羊種布魯氏菌生物2型，見表1。研究結(jié)果顯示，焉耆盆地奶牛布魯氏菌病的優(yōu)勢(shì)菌種為牛種布魯氏菌生物3型，主要監(jiān)測(cè)出于焉耆盆地的焉耆縣、和靜縣、博湖縣。

3 預(yù)防控制措施

奶牛養(yǎng)殖戶人畜共患病防護(hù)意識(shí)淡薄、牲畜調(diào)運(yùn)頻繁、運(yùn)輸環(huán)節(jié)監(jiān)管困難，對(duì)陽性牛撲殺、無害化處理措施不到位等原因病畜持續(xù)感染家畜，引起人的布魯氏菌病[6]。為了布魯氏菌病的預(yù)防和控制，我們要采取以下有效措施：

表1 奶牛分離菌株布魯氏菌種及其生物型的鑒定標(biāo)準(zhǔn)及鑒定結(jié)果

加大宣傳力度。以通俗易懂的防病科普教育，讓廣大養(yǎng)殖戶充分了解布魯氏菌病對(duì)人健康的危害，加強(qiáng)對(duì)獸醫(yī)工作者的技術(shù)培訓(xùn)，提高農(nóng)牧民養(yǎng)殖戶的自我保護(hù)防范能力[7]。

強(qiáng)化衛(wèi)生、做好消毒管理。養(yǎng)殖場(chǎng)嚴(yán)格按衛(wèi)生要求處理流產(chǎn)物、糞便及污染物，切斷病源傳播途徑。奶牛飼養(yǎng)場(chǎng)的金屬設(shè)施設(shè)備、圈舍、場(chǎng)地、車輛要定期消毒，注意母畜產(chǎn)前消毒。

定期檢疫凈化，徹底地?fù)錃㈥栃孕螅齻魅驹?，切斷傳播途徑，培育健康牛群[8]。

做好活畜交易市場(chǎng)的管理和檢疫[9]。

運(yùn)輸檢疫監(jiān)督對(duì)運(yùn)輸奶牛要嚴(yán)把檢疫監(jiān)督關(guān)，在購牛時(shí)必須從非疫區(qū)健康牛群中選擇[10]。

增加經(jīng)費(fèi)投入，確保防控經(jīng)費(fèi)到位，使防控?fù)錃o害化處理工作能夠順利開展[11]。

4 討 論

巴州地區(qū)奶牛主要分布于焉耆盆地。我們對(duì)焉耆盆地的奶牛布魯氏菌用布魯氏菌常用國際鑒定方法進(jìn)行分離鑒定。研究結(jié)果顯示，焉耆盆地引起奶牛布魯氏菌病的優(yōu)勢(shì)菌種為牛種布魯氏菌生物3型。新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)對(duì)兵團(tuán)十二師奶牛場(chǎng)布魯氏菌分離菌株用VirB8-PCR方法擴(kuò)增布魯氏菌的VirB8基因進(jìn)行鑒定，鑒定出布魯氏菌，同時(shí)采用布魯氏菌分子分型PCR方法進(jìn)一步對(duì)分離株鑒定，鑒定出牛種布魯氏菌[4]。隨著各種分子生物學(xué)、蛋白和基因工程技術(shù)的發(fā)展，布魯氏菌的研究不斷深入，其病原學(xué)研究必將獲得長足發(fā)展[5]。