◎ 劉岑岑，黃延盛，汪晨霞，陳貝貝，譚希明

（1.無(wú)限極（中國(guó)）有限公司，廣東 廣州 511447；2.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東 廣州 511447）

阿托品是存在于植物體內(nèi)的一種生物堿，具有顯著的生物活性，可用于鎮(zhèn)靜、止痛，但同時(shí)它也具有一定的毒性，可能會(huì)引起中樞神經(jīng)中毒[1]。

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越注重生活質(zhì)量，使得保健品具有極其廣闊的市場(chǎng)前景。但在利益驅(qū)使下，有一些不法商家可能會(huì)違規(guī)添加阿托品用于緩解胃潰瘍[2]，但若添加過(guò)量，將對(duì)消費(fèi)者的健康造成傷害，因此保健品的安全問(wèn)題引起了廣泛關(guān)注。但目前針對(duì)保健品中阿托品的檢驗(yàn)方法涉及較少，因此建立一個(gè)高效的針對(duì)保健品中阿托品的檢測(cè)方法對(duì)于嚴(yán)格控制保健品質(zhì)量具有非常重要的意義。

目前，應(yīng)用于生物堿檢測(cè)的主要方法包括薄層色譜法（TLC）[3]、高效液相色譜法（HPLC）[4]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[5]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[6]等，電噴霧質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，因此本研究采用超聲快速提取樣品，建立了一種同時(shí)測(cè)定保健品中阿托品的UPLC-MS/MS方法。

稱(chēng)取適量硫酸阿托品標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈配置成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000 μg/mL）。吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用空白基質(zhì)提取液稀釋定容，得到濃度為0.5、1.0、5.0、10、20 μg/L和50 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀及TSQ Endura三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司），MS3渦旋儀（德國(guó)IKA公司），KQ-250DV數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），3K15 離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司），Milli-Q超純水器（美國(guó)Millipore公司）。

硫酸阿托品（CAS：55-48-1）標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于98%，乙腈、甲酸（均為色譜級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Merck公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 樣品提取

稱(chēng)取0.5 g（精確至0.001 g）研磨成粉末的樣品于10 mL具塞比色管中，加入8 mL 0.1%甲酸水-乙腈（3∶1，v/v）渦旋混勻，超聲萃取15 min，然后用0.1%甲酸水-乙腈（3∶1，v/v）定容至10 mL。2500 r/min離心2 min，取1.0 mL上清液上機(jī)。

1.3.2 檢測(cè)條件

色譜柱：Waters ACQUITY HSS T3 液相色譜柱（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈，洗脫程序：0～6 min，70% A；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流速0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI+）；數(shù)據(jù)采集：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓：4000 V；離子化溫度：350 ℃，輔助氣流速：12 L/min；噴霧器溫度：400 ℃，鞘氣流速：30 L/min；碰撞氣：氬氣，1.0 mTorr；其他質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

表1 6種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)表

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，對(duì)阿托品的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果得出阿托品易在ESI+模式下得到[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)較強(qiáng)。然后選擇該特征準(zhǔn)分子離子峰為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，以響應(yīng)值最大的碎片離子定為定量離子，次級(jí)響應(yīng)最大的碎片離子定為定性離子，優(yōu)化射頻電壓及碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)。在此條件下阿托品的色譜圖如1所示。

圖1 阿托品的MRM色譜圖

2.1.2 色譜柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇兼容水相好，有封端封尾的Waters ACQUITY HSS T3柱進(jìn)行分析，阿托品保留效果好，峰形對(duì)稱(chēng)。

2.1.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

在電噴霧質(zhì)譜正離子模式下流動(dòng)相中加入酸性介質(zhì)，有利于被測(cè)組分的離子化，從而提高其質(zhì)譜響應(yīng)和檢測(cè)靈敏度。因此本實(shí)驗(yàn)選用乙腈-0.1%甲酸-水體系作為洗脫溶劑。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化

2.2.1 樣品提取溶劑

阿托品呈堿性，可用酸性溶劑提取，因此選用0.1%甲酸水-乙腈混合溶劑對(duì)樣品進(jìn)行提取。探討了0.1%甲酸水-乙腈不同配比對(duì)目標(biāo)物的提取效果，如圖2所示。結(jié)果表明，隨著混合溶劑體系中水相的增大，提取回收率在逐漸增加，用0.1%甲酸水∶乙腈=3∶1提取回收率可滿(mǎn)足檢測(cè)要求，因此選用該比例混合溶劑為保健品中目標(biāo)物的提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑回收率對(duì)比圖

2.2.2 樣品提取方式

考慮到保健品的形態(tài)多樣，樣品在提取溶劑中不易分散，因此采用超聲水浴提取，操作簡(jiǎn)單，可幫助樣品分散均勻、提高提取效率。本實(shí)驗(yàn)研究了不同超聲時(shí)間對(duì)目標(biāo)物提取效率的影響，結(jié)果顯示，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，目標(biāo)物的提取回收率增加顯著，到15 min后開(kāi)始變化不大，這說(shuō)明超聲時(shí)間大于15 min后，樣品的萃取過(guò)程已趨于一定的平衡，因此選擇15 min為實(shí)驗(yàn)的超聲時(shí)間。

2.3 方法學(xué)技術(shù)指標(biāo)考察

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

采用空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，這樣標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液都具有相似的基質(zhì)環(huán)境，從而確保線性方程的適用性。

2.3.2 線性范圍及方法檢出限

測(cè)定0.5～50 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作混合溶液，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度x（μg/L）為橫坐標(biāo)，質(zhì)譜響應(yīng)（y）為縱坐標(biāo)，得到阿托品線性回歸方程y=4683.26x-23.14，并計(jì)算得出方法的檢出限（MLODs，S/N=3）為 10 μg/kg。

2.3.3 方法精密度及回收率

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，選取膠囊、口服液、片劑3種基質(zhì)進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，添加3個(gè)加標(biāo)濃度，每個(gè)加標(biāo)濃度平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表2所示，3個(gè)添加濃度的回收率在85.5%～95.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～5.3%。

表2 5種生物堿加標(biāo)回收率及精密度表（n=6）

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)了本市市售的口服液、片劑和膠囊共20種不同類(lèi)型的保健品采用本方法進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出阿托品。

3 結(jié)論

本文選用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，開(kāi)發(fā)了一個(gè)測(cè)定保健品中阿托品的方法。通過(guò)優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)得到了最優(yōu)的檢測(cè)條件。該方法樣品前處理操作簡(jiǎn)單；阿托品檢測(cè)線性范圍寬、靈敏度高、檢出限低；所測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可為保健品的質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。