李向勇，靳元春，聶 瑜，粟玉剛，唐春華，李 芬

（1.長沙生態(tài)動物園，湖南長沙 410118；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128；3. 長沙市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖南長沙 410013；4. 長沙市望城區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖南長沙 410200）

獅弓蛔蟲（Toxascaris leonina）屬于蛔目（Ascaridida）蛔科（Ascaridae）弓蛔屬（Toxascaris），是貓科、犬科食肉動物（如虎、獵豹、猞猁、狼等）中較為常見的胃腸道寄生蟲[1]。獅弓蛔蟲可寄生于獵豹的胃部和腸部，掠奪獵豹的營養(yǎng)，影響其營養(yǎng)代謝，易引發(fā)胃腸炎、腸梗阻塞等疾病，嚴(yán)重時可導(dǎo)致感染動物死亡[2]。其幼蟲亦可感染人類，引發(fā)宿主胃腸道機(jī)械性損傷，屬于人獸共患寄生蟲[3-4]。另外，獅弓蛔蟲屬于土源性寄生蟲，其蟲卵可在土壤里存活數(shù)十日，易造成對宿主的反復(fù)感染，給我國珍稀野生動物保護(hù)工作帶來了極大影響與危害[5]。

傳統(tǒng)的寄生蟲種類鑒定以形態(tài)學(xué)特征為主要依據(jù)。但這種手段主觀性較大、周期性較長，且難以對形態(tài)相似蟲種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，因此單純的形態(tài)學(xué)鑒定法具有很大局限性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，選擇合適的基因片段作為標(biāo)記，可以更好地探究寄生蟲的遺傳變異情況。線粒體DNA（Mitochondria DNA）是胞核外環(huán)狀遺傳物質(zhì)，與核基因相比具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速率快、缺少重組等諸多特征[6]。此外，由于線粒體基因組序列容易測定，且具有較高的突變率，所以特別適合作為遺傳學(xué)研究的有效遺傳標(biāo)記[7]，目前已被許多學(xué)者用于多種寄生蟲的種間和種內(nèi)遺傳變異關(guān)系研究[8-10]。本研究以從湖南省長沙市生態(tài)動物園獵豹體內(nèi)采集的14條獅弓蛔蟲為研究對象，對其線粒體細(xì)胞色素c氧化酶I亞基基因（cox1）部分序列（pcox1）并進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和序列分析，從而明確該基因序列能否成為獅弓蛔蟲理想的種間遺傳標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣品

14條獅弓蛔蟲（CS1～14）樣品：采自湖南省長沙市生態(tài)動物園的獵豹糞便；單個樣品經(jīng)生理鹽水沖洗后，保存于70%酒精中。

1.2 主要試劑

DNA抽提試劑盒Wizard DNA Clean-up System、pGEM-T Easy載體試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞JM 109：Promega公司產(chǎn)品；蛋白酶K：Merk公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶、PCR試劑（Buffer、MgCl2、dNTPs等）、DL2000 DNA Marker：大連寶生物公司產(chǎn)品。

1.3 樣品DNA制備

將每個成蟲截取蟲體尾部小部分（1～2 cm），用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗3次后，分別放入1.5 mL的滅菌離心管中；用滅菌微型剪刀，將蟲體組織剪碎，分別加入 30 μL 蛋白酶 K（50 μg/μL）和 270 μL SDS裂解液，混勻后置于55 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)15～18 h，每隔1～2 h 震蕩1次。消化完全后，用Promega公司的DNA抽提試劑盒提取蟲體 DNA；將提取的DNA樣品置于?20 ℃條件下保存。

1.4 PCR擴(kuò)增

用文獻(xiàn)[11]報道的保守引物JB3和JB4.5擴(kuò)增

線粒體pcox1。其核苷酸序列如下：

JB3：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT -3′（24 bp）；

JB4.5：5′- TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′（24 bp）

引物由上海生工生物科技有限公司合成。擴(kuò)增體系為 25μL：ddH2O 16.25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，上下游引物（50 pmol/μL）各 0.5 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.25 μL，模板 DNA 1.0 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃變性15 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在1% TBE瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 擴(kuò)增片段克隆及篩選

以O(shè)MEGA Bio-Tek公司的DNA膠回收試劑盒，對所擴(kuò)增片段進(jìn)行純化；將純化產(chǎn)物連接到pGEM T Easy載體上；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 JM 109中，在含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB平板上，無菌挑選白色單菌落進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，篩選獲得陽性克隆。

1.6 cox1基因部分序列測定及進(jìn)化分析

將鑒定為陽性的重組菌送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果用DNA Star軟件進(jìn)行分析。從GenBank上下載具有代表性的其他線蟲的cox1序列，用Clustal X 2.0軟件，對獲得的cox1序列進(jìn)行相似性比對和種系發(fā)育分析。以綿羊夏柏特線蟲（Chabertia ovina）作為外群，用Phy ML 3.0程序中的最大似然樹法（ML），使用經(jīng)過篩選獲得的最佳建樹模型GTR，經(jīng)過100次bootstrap推演后，用Tree View 1.65程序繪制種系發(fā)育關(guān)系樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

14個樣品均擴(kuò)增出約400 bp的片段，與預(yù)期pcox1目的片段長度相符，且無非特異性條帶，空白對照為陰性。（圖1）

圖1 獵豹獅弓蛔蟲樣品cox1序列PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 測序結(jié)果及分析

擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果顯示：14個獵豹獅弓蛔蟲樣品pcox1堿基序列長度均為415 bp，剔除引物后，均得到367的序列；14個樣品pcox1序列的A+T含量（65.94%～66.21%）明顯高于G+C含量（33.78%～34.06%）。對14個樣品的pcox1序列進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)，獵豹獅弓蛔蟲cox1基因序列共有10個堿基發(fā)生變異，變異率為0～0.3%（表1）。將獲得的樣品序列與GenBank登錄號上發(fā)表的貓科動物東北虎、華南虎、猞猁（登錄號分別為JF780947、JF780950、JF780951）的相應(yīng)序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)cox1基因變異率為1.4%～4.1%。與犬科動物狐貍、狼、犬（登錄號分別為KX963448、JF780946、KC293930）的相應(yīng)序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)cox1基因變異率為5.3%～6.8%。對蛔目線蟲的cox1基因序列進(jìn)行種間分析發(fā)現(xiàn)，獵豹獅弓蛔蟲cox1序列與其他蛔蟲種存在較大差異，變異率為9.7%～21.4%。

表1 獵豹獅弓蛔蟲mtDNA cox1序列變異位點

2.3 cox1基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹

以綿羊夏柏特線蟲為外群，通過Phy ML 3.0程序中的ML法，構(gòu)建了種系發(fā)育樹（圖 2），發(fā)現(xiàn)獅弓蛔蟲可分為兩個分支：14個獵豹獅弓蛔蟲分離株與GenBank中收錄的東北虎、華南虎、猞猁（貓科動物）的獅弓蛔蟲參考株位于同一分支，GenBank中收錄的狼和犬（犬科動物）獅弓蛔蟲參考株位于另一分支。獵豹獅弓蛔蟲所屬分支與其它蛔目線蟲所屬分支相隔較遠(yuǎn)，得到了很好的區(qū)別。

圖2 基于pcox1基因序列以ML法構(gòu)建的獵豹獅弓蛔蟲系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

準(zhǔn)確鑒定寄生蟲種類是從事寄生蟲研究的重要科學(xué)問題之一，對防制寄生蟲病具有重要意義。傳統(tǒng)的寄生蟲分類主要根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行。但隨著時間的推移和生物種群的進(jìn)化，形態(tài)學(xué)鑒定的局限性愈加明顯，如對近緣種而言，很難從形態(tài)學(xué)上對寄生蟲進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，選擇合適的基因作為標(biāo)記，可以更好地探究寄生蟲的遺傳變異情況，從而為此問題的解決開辟了新途徑。線粒體基因作為一種核外遺傳物質(zhì)，具有分子量小，很少發(fā)生基因重組，基本上為母系遺傳，突變率高等特點，十分適合作為分子標(biāo)記進(jìn)行生物分類和種系發(fā)育方面的研究[12-14]。其中，cox1是線粒體基因組中進(jìn)化速率較慢的，目前已被許多學(xué)者作為分子標(biāo)記應(yīng)用于寄生蟲的分類鑒定[15-17]。

本研究對來自湖南省長沙市生態(tài)動物園的獵豹獅弓蛔蟲線粒體pcox1基因序列進(jìn)行了遺傳變異分析。研究結(jié)果顯示，來自不同宿主的獅弓蛔蟲分離株之間的線粒體cox1基因序列差異性均小于6.8%，獅弓蛔蟲與其他相關(guān)蛔目線蟲相應(yīng)序列的差異性均大于9.7%，即種間差異明顯大于種內(nèi)變異，說明cox1基因可以作為種間遺傳標(biāo)記應(yīng)用于獵豹獅弓蛔蟲的種間鑒定。然而，不同宿主的獅弓蛔蟲分離株cox1基因序列差異性達(dá)6.8%，說明獅弓蛔蟲也許存在隱藏種，但是需要更多的數(shù)據(jù)去證實。采用ML法構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，14個獵豹獅弓蛔蟲分離株同GenBank中收錄的東北虎、華南虎、猞猁（貓科動物）的獅弓蛔蟲參考株位于同一分支，與GenBank中收錄的狼和犬（犬科動物）獅弓蛔蟲參考株關(guān)系最近，兩者共同形成一個大分支，且與其他蛔目線蟲所屬分支相隔較遠(yuǎn)，因而得到了很好的鑒別。這一結(jié)論與宋美冉等[18]對華南虎獅弓蛔蟲三種線粒體基因的遺傳進(jìn)化分析所得結(jié)論相符。本試驗為獵豹獅弓蛔蟲的分類鑒定以及進(jìn)一步的分子流行病學(xué)調(diào)查工作奠定了基礎(chǔ)。