王仰杰，周 鍵

（1. 安丘市興安畜牧獸醫(yī)管理站，山東安丘 262100；2. 安丘市畜牧局，山東安丘 262100）

肉雞大腸桿菌病是由禽病原性大腸埃希氏菌引起的一種急性或慢性細菌性傳染病[1]。該病菌血清型眾多，分布范圍較廣，表現形式復雜多變，具有較強的地域性，且易導致其他病原的并發(fā)感染或繼發(fā)感染，是危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的主要細菌性傳染病之一[2]。大腸桿菌在自然環(huán)境中分布很廣，在雞舍的墊料、飼料、糞便及灰塵中廣泛存在，是雞腸道內常在菌和條件性致病菌，其發(fā)生常與雞舍環(huán)境惡劣、空氣質量差、飼養(yǎng)密度高、免疫接種不到位、飼料或飲水污染等因素有關，引起的臨床癥狀主要表現為腹瀉，還可造成心包炎、肝周炎、臍炎、卵黃囊炎、輸卵管炎等。致病性大腸桿菌易產生耐藥性，這也是導致目前使用抗生素防治大腸桿菌病效果越來越不理想的主要原因。致病性大腸桿菌具有區(qū)域流行性，其致病性在不同地區(qū)也存在較大差異，因此加強本地區(qū)肉雞大腸桿菌病的診斷與防治研究具有重要意義。為有效診斷和控制雞場大腸桿菌病疫情，了解當地肉雞大腸桿菌的病原學特性及耐藥性，采用臨床診斷、細菌分離培養(yǎng)、鏡檢、生化試驗等方法，對安丘市某肉雞養(yǎng)殖場雞群進行了雞大腸桿菌病的診斷和菌株耐藥分析，以期為當地大腸桿菌病的診斷與防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來源 山東省安丘市發(fā)生疑似大腸桿菌病疫情的某飼養(yǎng)90 000只羅斯308品種的肉雞養(yǎng)殖場。該場養(yǎng)殖模式為籠養(yǎng)，采用自動加料、自助飲水、自動出糞方式。

1.1.2 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基：購自青島海博生物技術有限公司；細菌微量生化反應管：購自杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏染色液：購自濰坊康華生物技術有限公司；頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟、阿莫西林、氟苯尼考、恩諾沙星、新霉素、硫酸粘菌素、多西環(huán)素、替米考星：購自天津瑞普生物技術股份有限公司。

1.2 現場調查

到養(yǎng)殖場問詢，并到雞舍實地觀察雞群臨床表現，對死亡雞只進行剖檢觀察。

1.3 分離培養(yǎng)

將病死雞剖檢，無菌取肝臟在麥康凱培養(yǎng)基上進行三區(qū)劃線無菌接種，放置37 ℃恒溫箱，倒置培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)。挑取可疑單個菌落于普通瓊脂平板上進行三區(qū)劃線純培養(yǎng)，放置37 ℃恒溫箱，培養(yǎng) 18～24 h 后，4 ℃保存?zhèn)溆肹3-4]。

1.4 染色鏡檢

挑取單個細菌涂片，經革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)[5]。

1.5 生化試驗

將分離純化的細菌無菌接種于細菌微量生化反應管（枸櫞酸鹽酸、靛基質、M-R、V-P）中，然后放入恒溫箱，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察結果[6]。

1.6 藥敏試驗

采用紙片法，對分離菌株進行7種單一獸用抗菌藥物和8種聯合抗菌藥物的藥敏試驗，測量抑菌圈大小并記錄結果[7]。

1.7 藥物治療試驗

利用藥敏試驗篩選出的敏感藥物，對發(fā)病雞群進行藥物治療，每天記錄采食量和死淘率。

2 結果與分析

2.1 臨床及剖檢診斷

3 日齡雞群發(fā)病，采食量偏少，部分雞只出現閉眼、縮脖等癥狀，大群均勻度差，發(fā)病率為20%，死淘率為5%。剖檢10只病雞，均發(fā)現明顯的心包炎（圖1）、肝周炎（圖2）。根據臨床及解剖癥狀，判斷為疑似大腸桿菌感染。

圖1 病死雞心包炎癥狀

2.2 分離鑒定

分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 24 h后，可見邊緣整齊，稍凸起，表面光滑濕潤，直徑為1.5～2 mm的粉紅色小菌落（圖3）。經革蘭氏染色后，在油鏡下可見大量散在的、卵圓形或桿狀、中等大小的細菌。

2.3 生化試驗

挑取疑似大腸桿菌菌落，經純化培養(yǎng)后進行生化鑒定，發(fā)現靛基質試驗和MR 試驗均為陽性，枸櫞酸鹽酸試驗和VP 試驗均為陰性，均符合大腸桿菌的生化特性（表1、圖4）。

2.4 藥敏試驗

圖2 病死雞肝周炎癥狀

圖3 分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)

藥敏試驗結果表明（表2、圖5）：分離出的大腸桿菌對頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟，以及“頭孢噻呋鈉+硫酸粘菌素”“頭孢噻呋鈉+阿莫西林”“頭孢噻呋鈉+恩諾沙星”“頭孢噻呋鈉+新霉素”“替米考星+阿莫西林”“替米考星+頭孢噻呋鈉”達到了S級敏感。S級敏感比例從高到低依次為頭孢喹肟、“頭孢噻呋鈉+阿莫西林”“頭孢噻呋鈉+恩諾沙星”、頭孢噻呋鈉、“頭孢噻呋鈉+硫酸粘菌素”“頭孢噻呋鈉+替米考星”“頭孢噻呋鈉+新霉素”“阿莫西林+替米考星”。

表1 分離菌生化試驗鑒定結果

圖4 生化試驗前后試驗結果對比

對新霉素、硫酸粘菌素、“多西環(huán)素+氟苯尼考”“替米考星+硫酸粘菌素”達到I級敏感，敏感比例從高到底依次為新霉素、“替米考星+硫酸粘菌素”、硫酸粘菌素、“多西環(huán)素+氟苯尼考”。

對氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素達到R級敏感。

2.5 藥物治療試驗

根據藥敏試驗結果，選用頭孢噻呋鈉對患病雞群進行飲水治療，每天1次，用藥治療1 d后，死淘率明顯減少，采食量逐漸增加，連續(xù)使用4 d，死淘率降為0.2%。

3 討論

肉雞大腸桿菌病一年四季均可發(fā)生，冬季和夏季多發(fā)，飼養(yǎng)管理不當，如養(yǎng)殖密度過大、舍內氨氣濃度高、通風不暢、衛(wèi)生條件差等均可促進該病發(fā)生[8]。通過對該肉雞養(yǎng)殖場的現場調查及詢問了解，發(fā)現該場的飼養(yǎng)管理存在許多問題，主要表現在養(yǎng)殖密度大、氨氣濃度高、養(yǎng)殖用具消毒不徹底等，這是導致大腸桿菌病發(fā)生的重要誘因。

藥敏試驗結果顯示，該肉雞源大腸桿菌對頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟等β內酰胺酶類藥物表現敏感，因此該類藥物應作為肉雞養(yǎng)殖場今后大腸桿菌病防治的首選藥物。該肉雞源大腸桿菌對新霉素、硫酸粘菌素等藥物表現中度敏感，對氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素等藥物高度耐藥，與李海華等[9]、Tikhonova等[10]的研究結果一致。這與該場不按流程用藥，隨意加大藥物劑量，頻繁換藥等不合理使用這些藥物相關。

表2 藥敏試驗結果

圖5 藥敏試驗結果

表3 藥物治療結果

為了驗證聯合用藥效果，本研究進行了兩種藥物聯合用藥體外藥敏試驗，并同單一藥物使用效果進行了比較，發(fā)現大腸桿菌菌株對“頭孢噻呋鈉+阿莫西林”“頭孢噻呋鈉+恩諾沙星”的敏感性高于單一藥物。同時，將頭孢噻呋鈉同恩諾沙星、新霉素、硫酸粘菌素、替米考星組成聯合用藥，將阿莫西林同替米考星組成聯合用藥，均能達到敏感級別，且比“多西環(huán)素+氟苯尼考”“替米考星+硫酸粘菌素”等聯合用藥敏感性好，說明針對肉雞大腸桿菌病，選擇β內酰胺酶類藥物作為必要的抗菌藥物，同其他藥物聯合用藥，可達到最好的防治效果。

本試驗表明，藥敏試驗對于大腸桿菌病等細菌病的防治具有積極作用。由于在不同地區(qū)、不同雞只、雞只不同生長時期的藥敏結果不一樣，而大腸桿菌極易對抗菌藥物產生耐藥性，因此應盡可能通過藥敏試驗篩選敏感藥物進行防治。否則，耐藥性一旦產生，克隆株不斷向外界傳播，會導致養(yǎng)殖場內或周邊地區(qū)耐藥性的蔓延擴散[11]。因而，養(yǎng)殖企業(yè)應將大腸桿菌納入監(jiān)測目標，實時監(jiān)控其耐藥性的產生和發(fā)展過程，并根據監(jiān)測結果，制定科學、合理的防治方案。

4 結論

根據現場觀察、臨床癥狀、剖檢病理變化及實驗室檢測結果，最后確診該病為雞大腸桿菌病。分離的大腸桿菌菌株對頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟等β內酰胺酶類藥物表現敏感，因此該類藥物應作為該肉雞養(yǎng)殖場大腸桿菌病防治的首選藥物。該菌對新霉素、硫酸粘菌素等中度敏感，對氟苯尼考、恩諾沙星、多西環(huán)素等高度耐藥，說明養(yǎng)殖場需要科學合理使用抗菌藥物，避免長期使用單一藥物，可采取聯合用藥、輪換用藥、交叉用藥等多種方式。通過藥敏試驗篩選敏感藥物，對于雞大腸桿菌病的防治具有積極作用。